犬細小病毒VP2的原核高效表達及特異單克隆抗體的研制.pdf

1、犬細小病毒(Canine Parvovirus，CPV)是單股DNA病毒，無囊膜，基因組全長5323bp，VP2全長1755bp，其編碼的蛋白占整個衣殼蛋白的90％，是中和抗體的主要抗原表位，是制備CPV基因工程疫苗的重要侯選保護性抗原。CPV可引出嚴重的出血性腸炎和心肌炎。該病一年四季皆可發(fā)生，發(fā)病急、病程短、傳染性強、死亡率高，對實驗犬、軍犬、警犬等集中飼養(yǎng)的犬群具有很大的危險性，故對感染犬作出及時診斷，以便采取措施防止蔓延甚為重要

2、。本研究對VP2基因分段進行原核表達，以CPV-VP2基因重組質(zhì)粒為模板，通過蛋白質(zhì)分析軟件分析，把VP2基因分成不同區(qū)段，設(shè)計相應(yīng)引物并擴增出相應(yīng)片段。按常規(guī)方法克隆入pGEX-4T-2載體谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)目的基因片段的表達，經(jīng)超聲處理后SDS．PAGE電泳證明K2和K4片段獲得了良好的可溶性表達，其表達的GST融合蛋白的分子質(zhì)量分別為38.3KDa和41KD

3、a，并對表達的融合蛋白進行了純化。經(jīng)過間接ELISA、Westem blot鑒定，表明采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)所表達的融合蛋白具有與CPV陽性抗體特異結(jié)合的良好抗原性。用純化的重組VP2融合蛋白作為篩選抗原，用提純的CPV作為免疫原，經(jīng)亞克隆得到6株穩(wěn)定分泌CPV-VP2單抗的雜交瘤，分別命名為：3D9C4、4F11D5、5F10F5、4F987、4G9G11、5F11C11；中和試驗表明：5F10F5、4F987、4G9G11、5F1

4、lCll四株有中和作用，且沒有發(fā)生與犬類其他病毒發(fā)生交互反應(yīng)的現(xiàn)象；經(jīng)鑒定5F11C11和4G9G11相對具有較高的分泌抗體能力，腹水的效價在1：10萬倍以上。之后，用直接ELISA方法區(qū)分了5F10F5、4F987、4G9G11、5F11C11四株分泌的針對CPV不同抗原決定簇的幾株單抗。結(jié)果表明，5F10F5、4G9G11與5F11C1l針對不同一抗原決定簇。上述成果可用于CPV特異性診斷、CPV病的抗體治療、VP2蛋白功能的研究和