抗鵝細(xì)小病毒VP3蛋白單克隆抗體的制備及對(duì)應(yīng)抗原表位的定位.pdf

1、小鵝瘟（Goslingplague，GP）又名鵝細(xì)小病毒病，是由鵝細(xì)小病毒（GooseParvovirus，GPV）引起雛鵝、雛番鴨以急性腸炎及肝、腎、心實(shí)質(zhì)器官炎癥為特征的烈性傳染病。GPV的致病性強(qiáng)，致死率高，對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)的影響嚴(yán)重，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于本病長(zhǎng)期困擾著養(yǎng)鵝業(yè)，因此制備單克隆抗體，并對(duì)相應(yīng)抗原表位進(jìn)行定位對(duì)本病的診斷和防治有重要意義。GPVVP3蛋白是鵝細(xì)小病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒的主要衣殼蛋白，暴露于病毒粒子表面

2、，含有GPV主要抗原決定簇，是GPV主要免疫保護(hù)性抗原，約占總蛋白的80％。因其能刺激機(jī)體產(chǎn)生具有中和作用的抗體，是研制基因工程重組疫苗的首選蛋白。通過(guò)免疫VP3蛋白制備抗GPVVP3的單克隆抗體，并利用單克隆抗體對(duì)GPVVP3的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行定位，有助于了解其抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，在小鵝瘟病的膠體金、ELISA等臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立，疫苗研制，疾病治療等方面起到重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用Ni-NTA親和層析純化后的

3、GPVVP3重組蛋白作為免疫原，經(jīng)腹腔接種免疫4～6周齡BALB/c小鼠3次，末次免疫3d后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，利用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行篩選，經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆，最終獲得4株能穩(wěn)定分泌抗GPVVP3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1F1、2A9、3811、4A2。亞類鑒定1F1為：IgG2b亞類，其余3株為IgG1亞類，輕鏈均為K鏈。EL，ISA檢測(cè)，其腹水效價(jià)分別達(dá)到1:819200、1:16

4、38400、1:409600、1:819200。Westernblot鑒定表明獲得的4株單抗均能特異性識(shí)別GPVVP3重組蛋白和GPVVP3天然蛋白；免疫電鏡和間接免疫熒光證明4株單抗能夠與GPV全病毒結(jié)合。
　　 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已鑒定的GPVVP3蛋白線性抗原表位區(qū)結(jié)果，設(shè)計(jì)并合成互相重疊5個(gè)氨基酸的10aa短肽寡聚核酸片段，退火后，連入pET-32a載體，誘導(dǎo)表達(dá)獲得相應(yīng)的小片段融合蛋白，利用制備的單抗通過(guò)Westernblot