西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的原核表達及其特異性單克隆抗體的研制.pdf

1、西尼羅河病毒(WNV)在病毒學分類上屬于黃病毒科黃病毒屬日本腦炎病毒血清群，因于1937年首次從非洲烏干達西尼羅河地區(qū)一名發(fā)熱的婦女血液中分離到病毒而得名。自然條件下，病毒存在于鳥—蚊子—鳥的傳播循環(huán)中，其中以庫蚊為主。人、馬經(jīng)帶毒蚊蟲的叮咬而感染，引發(fā)西尼羅河熱或西尼羅河病毒性腦炎。 根據(jù)已發(fā)表的序列，設(shè)計合成一對針對NY99株西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ基因序列的特異性引物，以引進的含WNVE蛋白基因的重組質(zhì)粒為模板，用聚合酶

2、鏈式反應(yīng)(PCR)擴增WNVE蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因，大小為360bp。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T/DⅢ，經(jīng)BamHI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收目的片段，克隆到pET-32a表達載體。通過PCR、酶切及測序鑒定證實結(jié)構(gòu)域Ⅲ基因以正確的閱讀框架插入了pET-32a載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導后，運用SDS-PAGE電泳分析表達產(chǎn)物并用WesternBlot進行鑒定

3、，結(jié)構(gòu)域Ⅲ融合蛋白的相對分子質(zhì)量約為30.3×103。親和層析法從表達產(chǎn)物中純化目的蛋白，從而為制備WNV實驗室診斷抗原和分析結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。 以純化的西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ重組融合蛋白為免疫原免疫BALB/c小鼠，運用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)進行細胞融合，并采用間接ELISA方法進行篩選，共獲得了3株能穩(wěn)定分泌針對西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的特異性單抗的雜交瘤細胞株，分別命名為4F7、6H3和8E4，其

4、單抗亞類鑒定分別屬于IgG1、IgG1和IgG2a。經(jīng)間接ELISA、免疫印跡和間接免疫熒光試驗鑒定，這3株單克隆抗體均能與重組西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ發(fā)生特異性反應(yīng)，而與日本腦炎病毒無交叉反應(yīng)，并且，8E4和6H3識別同一抗原位點，4F7識別西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的另一抗原位點。本實驗成功研制出針對西尼羅河病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的特異性單克隆抗體，為我國建立西尼羅河病毒的病原學檢測方法并與日本腦炎病毒進行鑒別診斷提供了有力的技術(shù)貯備