乙酰肝素酶的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：雖然已經(jīng)明確了HPSE在腫瘤轉(zhuǎn)移中的相關(guān)作用，但還有很多方面有待研究，為了研究HPSE在腫瘤發(fā)生、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移及血管生成中所起的作用，獲得大量的HPSE以及其抗體，就顯得很有必要。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得相關(guān)HPSE抗原，成功得到以包涵體形式表達(dá)的人全長HPSE蛋白，并運(yùn)用雜交瘤技術(shù)獲得抗HPSE的單克隆抗體。
　　方法：依據(jù)NCBI上公布的人HPSE cDNA序列，設(shè)計(jì)可以克隆HPSE全長片段的引物，選擇NcoⅠ和Xh

2、oⅠ作為酶切位點(diǎn)，將HPSE全長基因片段連接到pET28a(+)質(zhì)粒上，在大腸桿菌中表達(dá)HPSE蛋白；探索不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG以及所用的培養(yǎng)基對重組人HPSE蛋白表達(dá)的影響；運(yùn)用HisTrap TMcrude柱得到純度較高的重組人HPSE蛋白。
　　本室自制的重組人 HPSE50 kDa蛋白免疫 BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)將SP2/0與免疫B淋巴細(xì)胞融合，間接ELISA檢測抗體分泌情況，ELISA所用的抗原

3、為重組人HPSE全長蛋白、重組人HPSE50 kDa蛋白以及人HPSE多肽Lys158-Cys172，該多肽包含底物肝素與HPSE結(jié)合的特定序列，即HPSE的活性位點(diǎn)。陽性克隆進(jìn)行多次篩選以及亞克隆，得到抗HPSE的單克隆抗體。Western blot檢測所制備的抗原與抗體結(jié)合的特異性。
　　結(jié)果：成功在大腸桿菌中表達(dá)出重組人HPSE全長蛋白，并得到其最佳表達(dá)條件為：IPTG濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為5 h，在2×YT培養(yǎng)

4、基中誘導(dǎo)時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高。成功的篩選出兩株特異性較好抗HPSE的單克隆抗體，4D12、3F5效價(jià)均大于1:1.28×105，其親和力常數(shù)分別為2.71×109 M-1、6.67×108 M-1，4D12與50 kDa HPSE、人全長HPSE反應(yīng)，3F5與50 kDa HPSE、人全長HPSE以及HPSE50 kDa N端的Lys158-Cys172多肽反應(yīng)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了人HPSE原核表達(dá)系統(tǒng)，并篩選出兩株特異性好抗