鴨TLR5分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、楊美鑫鴨T L R 5 分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備 !鴨T L R 5 分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備研究生：楊美鑫導(dǎo)師：焦新安教授潘志明教授中文摘要T o l l 樣受體( T o l l ．1 i k e r e c e p t o r s ，T L R s ) 是一類跨膜蛋白家族，通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式( P a t h o g e n ．a(chǎn) s s o c i a t e d m o l e c u l a r p

2、 a t t e r n s ，P A M P s ) 誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。T L R s 被認(rèn)為是最有特點(diǎn)的先天性受體，在宿主抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。不同的T L R s 識(shí)別特定的分子標(biāo)志并且啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答，如T L R 2 和T L R 3 復(fù)合物或T L R 2 和T L R 6 復(fù)合物識(shí)別脂肽或脂蛋白，T L R 3 識(shí)別病毒的雙鏈R N A ，T L R 4 識(shí)別脂多糖，T L R 5 識(shí)別鞭毛蛋白，T L R 7 和

3、T L R 8 識(shí)別單鏈R N A ，以及T L R 9 識(shí)別細(xì)菌的C p G ．D N A 。T L R 5 是一類限制性表達(dá)受體，主要表達(dá)在上皮細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞( D C ) 等細(xì)胞的表面。鞭毛蛋白是T L R 5 的特異性配體，T L R 5 識(shí)別鞭毛蛋白后，啟動(dòng)M y D 8 8 依賴的信號(hào)通路，激活轉(zhuǎn)錄因子( N F ．r ．B ) 誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。目前，針對(duì)先天性免疫應(yīng)答的研究主要以人或小鼠為模型，

4、而對(duì)于家禽的研究則較為少見(jiàn)，主要是由于缺乏與家禽相關(guān)的生物試劑材料。因此，本研究構(gòu)建表達(dá)了鴨T L R 5 分子的胞外區(qū)( E C D ) 片段，并制備了針對(duì)T L R 5 ( E C D ) 的單克隆抗體，以期為家禽先天性免疫應(yīng)答研究提供材料。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期制備的鴨T L R 5c D N A 為模板，設(shè)計(jì)合成引物，利用高保真D N A聚合酶擴(kuò)增鴨T L R 5 ( E C D ) 基因片段，片段大小為1 6 0 8b p 。將擴(kuò)

5、增的目的基因片段連接于p M D 2 0 ．T 克隆載體，經(jīng)篩選鑒定正確后，將目的基因分別連接于原核表達(dá)載體p C o l d ．I和p G E X ．6 p ．1 ，經(jīng)篩選鑒定正確后，分別將構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒p C o l d ．I ．T L R 5 和p G E X ．6 p ．1 ．T L R 5 轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌B L 2 1 ，從而構(gòu)建出重組菌p C o l d ．I ．T L R 5 ／B L 2 1 和p G E X -

6、6 p ·1 - T L R 5 ／B L 2 1 。將重組菌p C o l d ．I ．T L R 5 ／B L 2 1 和p G E X ．6 p ．1 ．T L R 5 ／B L 2 1 分別接種于含有A m p 的L B液體培養(yǎng)基中，加入I P T G 誘導(dǎo)重組融合蛋白的表達(dá)，收集菌體，超聲波裂解菌體，離心后分別收集上清和沉淀進(jìn)行S D S ．P A G E 凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判定，重組融合蛋白r H i s ．T

7、 L R 5 和r G s t ．T L R 5 均表達(dá)在包涵體中。以重組融合蛋白r H i s ．T L R 5 為免疫原免疫6 ．8 周齡的雌性B A L B ／c 小鼠，應(yīng)用B 淋巴楊美鑫鴨T L R 5 分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制各 3 一P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no f d u c k T L R 5 a n d p r e p a r a t i o n o fI

8、t Sm o n 0 C 1 0 n a la n t l D 0 1 1 l e s A■ 1 一 ●●■ l ●M ．S ．c a n d i d a t e ：M e i x i nY a n gA d v i s o r s ：P r o f ．X i n a n J i a oP r o f ．Z h i m i n g P a nA b s t r a c tT o l l —l i k e r e c e p t o r

9、( T L R ) i sc o n d i s e r e d a s ac l a s s o f t r a n s m e m b r a n ep r o t e i n f a m i l yr e c o g n i z i n gp a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a r p a t t e r n ( P A M P ) a n d i n i t i a

10、t ei m m u n e r e s p o n s e ．T L Ri so n e o ft h eb e s t - c h a r a c t e r i z e di n n a t er e c e p t o r sw h i c h p l a ya c r u c i a lr o l e i n p r o t e c t i o n o f t h eh o s t f r o mp a t h o g e n

11、i n f e c t i o n ．V a r i o u sT L R s r e c o g n i z e i t sc h a r a c t e r i z e d t h e i rl i g a n d sa n d i n i t i a t et h e i n n a t e i m m u n e r e s p o n s e s ．F o r e x a m p l e ，t h e T L R 2 一T L

12、 R 3 c o m p l e x e s o r T L R 2 - T L R 6c o m p l e x e s C a n r e c o g n i z e l i p o p e p t i d e o rl i p o p r o t e i n ，v i r u sd s R N A f o rT L R 3 ，l i p o p o l y s a c c h a r i d e( L P S ) f o r T

13、L R 4 ，f l a g e l l i nf o rT L R 5 ，s i n g l eR N A f o r T L R 7 a n d T L R 8 ，u n m e t h y l a t e dD N A s f o rT L R 9 ．T L R 5 i s e x p r e s s e do n t h e s u r f a c eo fe p i t h e l i a l c e l l s ，m o n

14、 o c y t e s ／m a c r o p h a g e s a n dd e n d r i t i c c e l l s ( D C s ) ．F l a g e l l i n i s t h e u n i q u e l i g a n d f o r T L R 5 ．F l a g e l l i nC a na c t i v i a t e t h eT L R 5 ··m e d i

15、a t e d p a t h w a y , a n d t h e n i n i t i a t e t h e M y D 8 8 ·- d e p e n d e n t p a t h w a y a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o n f a c t o r s ( N F - K B ) ，a n df i n a l l yi n d u c e t h ep

16、 r o d u c t i o no f p r o i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e s ．A tp r e s e n t ，t h er e s e a r c ho nt h ei n n a t ei m m u n er e s p o n s em a i n l yf o c u s e d o n m i c ea n dh u m a n s ，b u t f o rp

17、o u l t r y r e s e a r c h i s r e l a t i v e l y r a r e ．T h e s h o r t a g e o fr e l a t e db i o l o g i c a l m a t e r i a l sa n dr e a g e n t s h e a v i l yr e s t r i c t e dt h er e s e a r c h o np o u l

18、 t r y ．T h e r e f o r e ，w ec o n s t r u c t e da n d e x p r e s s e dt h ee x t r a c e l l u l a rd o m a i n ( E C D ) o f d u c kT L R 5p r o t e i na n dp r e p a r e d t h em o n o c l o n a l a n t i b o d i e

19、 sa g a i n s ti t ．T h e s ea n t i b o d i e s c o u l db e u s e f u lf o rt h ea n a n l y s i s o f i n n a t ei m m u n e o np o u l t r y ．I nt h i s s t u d y , w ed e s i g n e dt h ep r i m e r sf o ra m p l i

20、f i c a t i o no fT L R 5e x t r a c e l l u l a rd o m a i n( E C D ) f r o mt h e d u c kc D N Ao fT L R 5 s t o r e d i n o u rl a b o r a t o r y ．T h e h i 曲f i d e l i t y D N Ap o l y m e r a s eW a su s e dt o c

21、l o n e t h ef r a g m e n to f 16 0 8b p ，w h i c h w a st h e nl i g a t e dt ot h ec l o n i n gv e c t o rp M D 2 0 一T ．A f t e ri d e n t i f i c a t i o nb ys e q u e n c i n g ，t h et a r g e tg e n eT L R 5 ( E C