雞CD8a基因的克隆,原核表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴細(xì)胞表面重要的標(biāo)志性分子之一。不同于單鏈形式的CD4分子，CD8分子是二聚體，并且有αα同型二聚體和αβ異型二聚體兩種表達(dá)形式。雞CD8分子主要表達(dá)于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的表面。其中，CD8αα同型二聚體一般表達(dá)于外周CD4+T淋巴細(xì)胞，而CD8αβ異型二聚體僅表達(dá)于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。CD4主要識別MHCⅡ類分子遞呈的外源性抗原；而CD8主要識別MHCⅠ類分

2、子遞呈的內(nèi)源性抗原，同時，CD8與MHCⅠ類分子的相互作用能夠顯著增強(qiáng)MHC分子與TCR之間的親和力。距今為止，普遍公認(rèn)CD8分子具有輔受體功能，輔助TCR的信號傳遞。最近的研究表明，CD8αα分子還可以作為輔阻遏物，調(diào)節(jié)TCR的活性。雞CD8分子是雞免疫系統(tǒng)的重要組成部分，與哺乳動物的CD8分子在生物進(jìn)化和功能上有明顯的相似性，顯然，CD8分子與雞的免疫防御系統(tǒng)密切相關(guān)。
　　 首先參照NCBI 數(shù)據(jù)庫中登陸的雞CD8α、CD

3、8βcDNA序列，應(yīng)用軟件PrimerPremier 5.0分析雞CD8α、CD8β基因完整序列，設(shè)計兩對引物。通過RT-PCR技術(shù)，從雞胸腺組織總RNA中分別擴(kuò)增出兩條特異性基因片段，經(jīng)測序鑒定，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有的雞的CD8α和CD8β基因序列同源性均超過98％。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到pMD18-T 載體，經(jīng)菌液PCR篩選出陽性重組克隆后進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明本實驗成功的克隆到雞CD8α和CD8β基因，兩者分別由710和7

4、11個核苷酸組成。
　　 根據(jù)本實驗測定的雞CD8α基因序列和原核表達(dá)載體pET-32a的多克隆酶切位點序列設(shè)計兩對引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pMD18-T-CD8α中擴(kuò)增出編碼雞CD8α分子膜外區(qū)的基因片段，基因片段長為510bp。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到原核表達(dá)載體pET-32a的多克隆酶切位點，經(jīng)菌液PCR和EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建成CD8α基因膜外片段的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-C

5、D8α。將pET-32a-CD8α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rostta，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，SDS-PAGE 凝膠電泳表明,克隆的基因片段在大腸桿菌Rostta中得到表達(dá)，表達(dá)出融合蛋白His-CD8α，且表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白分子量約39 KD，與預(yù)期結(jié)果相符。
　　 最后，通過優(yōu)化表達(dá)條件，確定了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-CD8α的最佳誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)劑濃度，用優(yōu)化的原核表達(dá)條件對含有pET-32a-CD8

6、α質(zhì)粒的Rostta 菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了較高濃度的His-CD8α包涵體蛋白。用純化后的融合蛋白His-CD8α免疫Balb/c 小鼠。利用細(xì)胞融合技術(shù)，制備針對雞CD8α的單抗。最后經(jīng)間接ELISA、Western-blot 鑒定表明，本實驗成功制備了一株能夠穩(wěn)定分泌抗雞CD8α的特異性單抗α-1細(xì)胞株。單抗亞類鑒定結(jié)果顯示，單抗屬于IgG2b 亞類。
　　 綜上所述，本實驗成功克隆了雞CD8α的膜外區(qū)基因，構(gòu)建了重