卵巢癌HE4基因的克隆、表達及單克隆抗體的制備.pdf

1、卵巢癌發(fā)病隱匿，預(yù)后差，是女性最致命的惡性腫瘤之一。如果能在早期診斷卵巢癌將大大提高治愈率，但是卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)到了晚期。傳統(tǒng)的治療方法，包括手術(shù)、放射治療、化學(xué)藥物治療等，一般難以治愈卵巢癌，其存活率低于20％。 目前診斷卵巢癌和監(jiān)測其復(fù)發(fā)最為敏感的指標(biāo)是檢測血清CA125。晚期卵巢癌患者中有80％能檢測到CA125的升高，而在早期僅為50～60％，由于CA125在某些良性疾病中也會上升，導(dǎo)致一些不必要的手術(shù)，大大限制

2、它的臨床應(yīng)用。于是，許多學(xué)者正致力于尋找更為有效的腫瘤標(biāo)記物，以便早日確診卵巢癌。 HE4基因是新近提出的卵巢癌腫瘤標(biāo)記物，有學(xué)者認為HE4可以聯(lián)合CA125(甚至取代CA125)來提高卵巢癌的診斷水平。Schummer(1999年)等發(fā)現(xiàn)HE4(WFDC2)mRNA在卵巢癌組織中高表達，而在癌旁組織中不表達。該基因編碼的蛋白質(zhì)與細胞外蛋白酶抑制劑有很高的同源性，但未發(fā)現(xiàn)HE4具有蛋白酶抑制的作用，HE4的功能尚不清楚。

3、 Hellstrom(2003年)比較卵巢癌患者及正常人血清中的HE4蛋白量，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)卵巢癌患者血清中HE4蛋白有明顯增加，而正常組織及良性疾病中含量很低，用于卵巢癌診斷的價值優(yōu)于CA125。但Bingle報道HE4也在正常組織中存在并經(jīng)過復(fù)雜的剪切過程，提示HE4雖然不是卵巢癌的特異性腫瘤標(biāo)記物，但由于存在量的區(qū)別，定量檢測仍可用來篩查卵巢癌。 我們提取卵巢癌細胞H08910的總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴增HE4基因，然

4、后將該片段進行T-A克隆并測序鑒定，純化回收后亞克隆于原核表達載體PGEX-4T-1中，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，重組子在TOP10宿主菌中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，純化的重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體，運用ELISA、Western-blot進行抗原性分析。 結(jié)果顯示，擴增到一條大小約為400bp的片段，經(jīng)T-A克隆與測序鑒定，測定的序列與GenBank中報道的HE4基因序列一致。將PGEX-4T-1重組子轉(zhuǎn)化宿主菌，用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)

5、SDS-PAGE電泳和Westernblot鑒定證實，在相對分子質(zhì)量約39kDa處可見明顯的特異性的表達條帶，表達產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，破菌后的上清中也有少量HE4蛋白。表達量約占菌體總蛋白的13.6％，用鼠抗GST抗體對表達產(chǎn)物進行Western-blot分析，發(fā)現(xiàn)特異性條帶出現(xiàn)在39kDa處，表明該蛋白為新增的GST融合蛋白。進一步用純化的表達產(chǎn)物免疫小鼠制備免疫血清，ELISA和Westernblot分析表明該免疫血清能與HE

6、4蛋白起反應(yīng)，說明重組蛋白具有免疫活性。 用純化的蛋白免疫小鼠制備了四株單抗，4A5細胞分泌的單抗類型為IgG2b，6B1、6C7細胞分泌的單抗類型為IgG2a，2F11分泌的單抗類型為IgG1。四株單抗培養(yǎng)上清的ELISA效價為1：128～1：256。Westernblot結(jié)果顯示四株單抗均能識別融合蛋白，說明四株單抗均為HE4特異性單抗。 以上結(jié)果表明，我們已經(jīng)在國內(nèi)首次成功地構(gòu)建了pGEX-HE4重組質(zhì)粒，并在大腸