降鈣素原的重組、表達及單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：在嚴重細菌感染性疾病的診斷中，降鈣素原以其潛在的應(yīng)用價值已成為應(yīng)用研究熱點。降鈣素原(procalcitonin，PCT)是無激素活性的降鈣素(calcitonin，CT)前肽物質(zhì)，為含116個氨基酸的糖蛋白，半衰期為20-24小時，在體內(nèi)穩(wěn)定性好。在正常及健康的個體中，PCT經(jīng)一系列的酶催化作用最后水解形成CT，故其血清PCT的濃度極低，僅為10－50pg/ml，一般的方法檢測不到。在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)、敗血癥、敗血

2、癥休克等嚴重細菌感染患者的血清PCT顯著升高，其濃度可達正常水平的幾倍甚至上萬倍，并且PCI、濃度和疾病嚴重程度成正相關(guān)，并隨著病情的發(fā)展變化而變化，因而PCT可作為診斷嚴重細菌感染、判斷病情與預(yù)后以及療效觀察的可靠指標。 本實驗根據(jù)Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密碼子，改變部分堿基序列但保持其氨基酸序列不變，采用多引物人工一步合成基因技術(shù)合成降鈣素原的全長基因，并將其構(gòu)建于原核表達載體pGEX-4T-1中，得到

3、重組表達載體pGEX-41-1/PCT，將pGEX-4T-1/PCT轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后進行誘導表達，得到融合蛋白經(jīng)純化后進行動物免疫，用改良了的方法進行細胞融合后，采用細胞篩選方法以獲得可穩(wěn)定分泌鼠抗人PCT蛋白的雜交瘤細胞株，為日后制備抗PCT單克隆抗體，制備檢測PCT試劑盒及研究PCT的來源、生理病理功能等提供了良好的實驗基礎(chǔ)。 結(jié)論：1．根據(jù)Genbank的人源PCT全序列修改了部分稀有密碼子但保持其氨基酸序列不變，使

4、目的基因能在大腸桿菌中高效表達。2．改變傳統(tǒng)的直接從基因庫中提取目基因的方法，而改為采用多引物人工一步合成基因技術(shù)成功合成了PCT的全長基因，并得到了高效表達的GST-PCT蛋白，為制備抗PCT單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。3．應(yīng)用雜交瘤細胞篩選技術(shù)成功得到2株可穩(wěn)定分泌鼠抗人PCT蛋白的雜交瘤細胞株，分別命名為6A4、7D6，經(jīng)檢測具有高特異性和親和力，為嚴重細菌感染性疾病的診斷提供了重要手段，為深入研究PCT的來源、病理生理作用以及臨床應(yīng)用