豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）為圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬成員，分為PCV1和PCV2兩個(gè)血清型。PCV1不引起豬發(fā)?。坏荘CV2不僅是原發(fā)性斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PWMS）的主要病原，還與許多疾病密切相關(guān)。PCV2能在豬單核巨噬細(xì)胞中增殖，造成免疫細(xì)胞數(shù)量減少和對(duì)病原缺乏有效的免疫應(yīng)答能力。建立對(duì)該病原和感染血清抗體檢測(cè)對(duì)有效防治本病具有重要意義。
　　 本研究采用PCR方法擴(kuò)增了去除核定位信號(hào)序

2、列的PCV2 ORF2基因片斷約576bp，將所得片斷與表達(dá)載體pPRO-HTb進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組菌經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)初步證明PCV2 Cap蛋白獲得了表達(dá)，產(chǎn)物分子量約為27ku，Western-Blot分析，所表達(dá)的蛋白能與PCV2陽(yáng)性抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為以重組蛋白為檢測(cè)抗原建立PCV2血清抗體檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
　

3、　 重組蛋白經(jīng)純化和復(fù)性免疫BALB/c小鼠，按常規(guī)方法取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫小鼠脾細(xì)胞融合，制備了雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)有限稀釋經(jīng)３～4次篩選、克隆，獲得了3株穩(wěn)定分泌抗體的抗PCV2-Cap蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，3株單抗分別命名為1C2，3C11和3E11。其細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)分別為1:l600、1:12800和1:l600；3株單抗的Ig亞類均為IgM；Western-blot分析、Dot-ELISA和間接免疫熒光結(jié)果顯