豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達及表達產(chǎn)物在ELISA建立和單克隆抗體制備中的應用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，它不但可以引起斷奶仔豬發(fā)生衰竭、死亡，還與多種疾病的發(fā)生密切相關。這些疾病的廣泛流行嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)，給好多國家和地區(qū)帶來巨大的損失。PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估計。PCV2已經(jīng)成為嚴重阻礙

2、養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一。目前，還沒有一種可靠的、適于大規(guī)模診斷和檢測PCV2的方法，其原因在于PCV1在豬群中的感染比較普遍，且與PCV2的核苷酸同源性較高，存在抗原交叉現(xiàn)象，現(xiàn)有的檢測方法或者難以將其區(qū)分，或者不適合大規(guī)模的臨床樣本檢測與開展流行病學調(diào)查。PCV2特異性的抗原位點主要集中在ORF2區(qū)域。ELISA方法適用于大規(guī)模的臨床樣本檢測，若用PCV2 ORF2的表達產(chǎn)物建立ELISA檢測方法就能夠達到既區(qū)分PCV1和PCV2又

3、能夠進行規(guī)?；瘷z測的目的。而對于疾病的防制最根本是要建立抗原檢測方法，用抗PCV2 ORF2蛋白的單抗建立檢測PCV2抗原的方法可以盡早檢出圓環(huán)病毒，從而可盡早防治。 本實驗就是通過分子生物學手段將PCV2 ORF2進行了體外表達，并對表達的蛋白進行了純化復性。以純化復性蛋白為免疫原分別進行了多克隆抗體及單克隆抗體的制備工作。以期為綜合防制該病提供新的實驗依據(jù)。 本論文的實驗由三部分構成，一是克隆出PCV2的ORF2基因

4、，利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，通過基因重組技術表達出ORF2基因，二是利用表達蛋白建立間接ELISA檢測方法，三是用表達的蛋白免疫新西蘭大白兔和Balb/c小鼠，制備抗PCV2 ORF2蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，用所建立的間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選，以期獲得高效穩(wěn)定分泌抗PCV2 ORF2蛋白抗體的雜交瘤細胞株。主要結果如下： 1．參照已發(fā)表的PCV2基因組序列，設計引物，擴增PCV2 ORF2基因的后部約580b

5、p片斷。與載體pET-32a Vector連接，轉化BL21-△E3細胞后挑取陽性克隆，經(jīng)酶切鑒定和測序驗證后用IPTG進行誘導，SDS-PAGE分析，表明ORF2基因均在大腸桿菌中得到了表達。其表達量約為菌體蛋白的30％。Western blot表明PCV2 ORF2表達產(chǎn)物分子量約為28ku。 2．將表達的PCV2 ORF2蛋白純化并復性，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測未見其他雜帶。純化后的蛋白按照墨克蛋白復性試劑盒說明書進

6、行了復性。經(jīng)Western blot檢測表明，復性后的重組蛋白能被PCV2多克隆陽性血清所識別。具有良好的反應原性。 3．純化復性的PCV2 ORF2蛋白作為包板抗原建立間接ELISA檢測方法。通過對抗原包被濃度、抗體稀釋度、二抗?jié)舛?、各步驟作用時間等的摸索，得出了重組抗原最適包被濃度為0.5mg/L，最適包被條件為4℃過夜，血清稀釋度為1：160，酶標二抗工作濃度為1：7500，待檢血清和酶標二抗的反應時間均為37℃45min，底物3

7、7℃顯色10min。阻斷試驗表明建立的間接ELISA對PCV2抗體具有很好的特異性。板內(nèi)和板間重復性試驗結果為，同1份血清板內(nèi)各孔的變異系數(shù)均值為2.78％，板間同一份血清OD值變化也不大。表明本方法的重復性好。 4．用復性的PCV2 ORF2蛋白免疫了家兔和Balb/c小鼠，制各了高效價的多克隆抗體。ELISA方法檢測兔和小鼠抗PCV2 ORF2蛋白多克隆抗體的效價分別達到了1：12800及1：10<'7>。用復性的PCV2