豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1和ORF2基因的克隆與表達(dá)及TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，分為Ⅰ型(PCV1)和Ⅱ型(PCV2)兩個(gè)型，其基因組為共價(jià)閉合環(huán)狀的單鏈DNA，大小約1.7kb，其中豬工工型圓環(huán)病毒(porcine circovirus 2,PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合(postweaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)的主要病原，它不但可引起斷奶仔豬發(fā)生衰竭、死亡，還與仔豬先天

2、性震顫fcongential tremor，CT)、懷孕母豬流產(chǎn)(reproductive failure)、成年豬皮炎腎炎綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy．syndrome,PDNS，)和呼吸道疾病綜合征(porcinerespiratory disease syndrome,PRDS)有關(guān)。這些疾病的廣泛流行嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)，給很多國家和地區(qū)帶來巨大的損失，更為嚴(yán)重的是PCV2的感染可以造成

3、免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估計(jì)。。PCV2已經(jīng)成為嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一。因此，對(duì)本病毒的研究也逐步深入。我國是養(yǎng)豬大國，對(duì)該病及其病原進(jìn)行研究更具有重要的意義本論文的實(shí)驗(yàn)由兩部分構(gòu)成： 1，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF1和ORE2基因的克隆與表達(dá)。 根據(jù)GenBank豬圓環(huán)病毒2型基因序列，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物，對(duì)廈門株-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ORF1和ORF2基因。將PCR產(chǎn)物酶切后

4、，插入到pET-22b載體中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。確定重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)，包涵體洗滌溶解后，采用Ni<'2+>離子金屬螯合親和層析柱純化蛋白，逐步透析法進(jìn)行復(fù)性，ELISA實(shí)驗(yàn)證明Rep蛋白和Cap蛋白均能與PCV2陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。 2，豬圓環(huán)病毒Ⅱ型TaqMan熒光定量PCR

5、檢測方法的建立與初步應(yīng)用參照GenBank收錄的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)基因組全序列選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成了引物及其探針，并對(duì)其進(jìn)行了篩選；對(duì)熒光定量PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了TaqMan熒光定量PCR檢測方法。用建立的檢測方法對(duì)臨床采集的組織病料進(jìn)行了檢測，并與常規(guī)PCR作對(duì)比。結(jié)果顯示，所建立的方法靈敏度可達(dá)3.0×10<'3>拷貝λL，比常規(guī)PCR靈敏度高10倍，而與PCV1、CSFV、PRRSV和PRV沒有交反應(yīng)，具有靈