豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因及ORF1-2串聯(lián)基因重組腺病毒對(duì)小鼠免疫效果的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無(wú)囊膜單股環(huán)狀DNA病毒，是迄今已知最小的動(dòng)物病毒之一。根據(jù)PCV的抗原性和基因組成不同，將其分成兩種不同的基因型即PCV1和PCV2。PCV1無(wú)致病性，但廣泛存在于豬體內(nèi)及部分豬源傳代細(xì)胞系；PCV2具有致病性，可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post- weaning multisystemic wasting syndrom，PMWS)。

2、 PCV2基因組含有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，其中ORFl編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)，ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)，具有病毒的主要的抗原中和表位。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，將凍存的重組腺病毒重新培養(yǎng)后，對(duì)其進(jìn)行PCR、酶切、測(cè)序和 Western-blot鑒定。然后將重組腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORFl-2和Ad-ORFl、Ad-ORF2混合毒以及空載體腺病毒Ad-C、PBS分別免疫6周齡Balb/c小鼠，在

3、初次免疫后的第2周和第4周分別加強(qiáng)免疫一次。第三次免疫后兩周每組分別取5只小鼠，眼球采血后處死。在無(wú)菌條件下，取脾臟分離淋巴細(xì)胞，測(cè)定脾細(xì)胞中Th、Tc和B細(xì)胞亞群的含量以及脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、NK細(xì)胞的自然殺傷活性、CTL的特異性殺傷活性。同時(shí)測(cè)定各組小鼠血清的PCV2 ORF2特異性抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組腺病毒重新培養(yǎng)后經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定，證實(shí)目的基因插入正確，無(wú)丟失和變異現(xiàn)象發(fā)生；熒光顯微

4、鏡觀察和Western-blot檢測(cè)顯示，重組腺病毒能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，而且目的蛋白能被PCV2感染豬的陽(yáng)性血清所識(shí)別。 2.重組腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2和Ad-ORF1、Ad-ORF2混合病毒經(jīng)肌肉途徑免疫Balb/c小鼠后，隨著免疫次數(shù)的增加小鼠產(chǎn)生的針對(duì)PCV2 ORF2基因的特異性抗體水平不斷升高，第3次免疫后2周達(dá)到最高，但第3次免疫后4周有所下降；與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組都能夠引起小鼠脾細(xì)胞中Th、Tc

5、亞群含量的增加，但B淋巴細(xì)胞的百分含量無(wú)明顯變化，實(shí)驗(yàn)組間Th和Tc亞群的百分含量無(wú)顯著差異(P>0.05)：脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，試驗(yàn)組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組比較均有顯著的差異，但實(shí)驗(yàn)組間脾淋巴細(xì)胞的增值能力無(wú)顯著差別(P>0.05)；NK細(xì)胞自然殺傷活性實(shí)驗(yàn)顯示，試驗(yàn)組小鼠的NK細(xì)胞自然殺傷活性對(duì)照組比較均有顯著的差異，Ad-ORF2組和Ad-ORF1+Ad-ORF2組小鼠的NK細(xì)胞自然殺傷活性高于Ad-ORF1+2組(

6、P<0.01)，Ad-ORF2組和Ad-ORF1+Ad-ORF2組小鼠的NK細(xì)胞自然殺傷活性差異不顯著(P>0.05)；CTL殺傷活性實(shí)驗(yàn)表明，試驗(yàn)組小鼠的CTL殺傷活性與對(duì)照組比較均有顯著的差異，Ad-ORF1+Ad-ORF2組小鼠的CTL殺傷活性最高，Ad-ORF2組小鼠的CTL殺傷活性(P<0.01)最低。本研究以Balb/小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)重組腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2及Ad-ORF1+Ad-ORF2混合毒的免