豬Ⅱ型圓環(huán)病毒感染性克隆的構(gòu)建及其ORF1的克隆表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circoviru，PCV)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動(dòng)物病毒之一，分為兩型：PCV1和PCV2，二者都屬于圓環(huán)病毒屬。PCV2被認(rèn)為是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的病原，而PMWS給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此PCV2成為研究的熱點(diǎn)。本研究從具有PMWS臨床及病理變化的淋巴結(jié)中克隆得到PCV2的全基因組序列，構(gòu)建

2、了PCV2突變體的感染性克隆；同時(shí)，本研究還克隆了PCV2 ORF1基因，并在E．coli中成功表達(dá)。 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用PCR方法直接從病料中擴(kuò)增出PCV2的全基因組序列，將擴(kuò)增片段克隆于pGEM-T easy載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明PCV2基因組全長(zhǎng)為176Tbp，命名為ZHEJIANG2006(GenBank登錄號(hào)EF210106)。應(yīng)用DNAstar序列分析軟件分析結(jié)果表

3、明，本研究的PCV2序列與國(guó)內(nèi)外其它研究中的PCV2序列密切相關(guān)，核苷酸序列同源性達(dá)95.1％-99.1％，其中ORFI和ORF2所編碼的氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外其它研究中的PCV2序列比較，同源性也很高，分別為96.2％-99.7％和91.0％-98.7％。 利用重疊延伸法將PCV2 ZHEJIANG2006序列中1162位T→G，1164位C→T，使其ORF2編碼的氨基酸第191位Gly→ser。突變后的全序列克隆入pBluesc

4、ript Ⅱ SK(+)的SacI酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pSK-PCV2(突)。其后從大量擴(kuò)增的pSK-PCV2(突)酶切得到1767bp的PCV2(突)全長(zhǎng)，體外連接環(huán)化后，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，并且同時(shí)轉(zhuǎn)染pSK-PCV2(突)做為陰性對(duì)照。經(jīng)多次傳代后，用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)證實(shí)環(huán)化的PCV2(突)基因組在細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)。 設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增PCV2上長(zhǎng)945bp的ORF1序列，并將其克隆入原核表達(dá)載體p