豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的原核表達(dá)及其在PCV2抗體檢測ELISA方法建立和單克隆抗體制備中的應(yīng)用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)近年來被認(rèn)為是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的致病因子。PMWS主要引起斷奶保育豬進(jìn)行性消瘦。自1991年在加拿大健康斷奶仔豬群中首次發(fā)現(xiàn)PMWS以來，世界上許多養(yǎng)豬國家和地區(qū)都報道了該病的發(fā)生和流行。本病主要臨床癥狀為消瘦、呼吸困難、淋巴結(jié)腫大、腹瀉、蒼白及黃疸。

2、 診斷PCV2最常用的血清學(xué)方法包括間接免疫熒光試驗(IFA)和免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)。間接免疫熒光試驗與免疫過氧化物酶單層試驗需要專業(yè)的實驗技術(shù)人員且繁瑣耗時。酶聯(lián)免疫吸附試驗克服了間接免疫熒光試驗與免疫過氧化物酶單層試驗中人為因素造成的偏差，體現(xiàn)出其獨(dú)特的優(yōu)越性。最近用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測PCV2感染多見報道，其中用PCV2單克隆抗體建立的間接競爭EL．ISA表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性。 本研究根據(jù)豬圓環(huán)病毒

3、2型(PCV2)南農(nóng)株的全基因組序列(DQ104422)，設(shè)計一對引物，利用PCR技術(shù)，從PCV2毒株中擴(kuò)增出不含核定位序列的ORF2基因，并克隆入pGEM-T easy載體中，根據(jù)藍(lán)白斑篩選及限制酶酶切分析得重組質(zhì)粒pGEM-ORF2。經(jīng)序列測定驗證正確后，將目的基因克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6P-1的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的下游，獲得重組質(zhì)粒pG：EX-ORF2。把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在37℃、IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)

4、行表達(dá)。通過對重組大腸桿菌的菌體裂解物的SDS．PAGE電泳分析及Western-blot鑒定，表明重組菌能正確表達(dá)GST-Cap融合蛋白。 利用原核表達(dá)的豬圓環(huán)病毒2型重組融合蛋白作為抗原，建立了檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的間接ELISA方法。對ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇重組蛋白抗原的最適包被濃度為3gg/ml，最適包被條件為常溫(約25℃)1h加4℃過夜，待檢血清稀釋度為1：200。包被的重組蛋白不與豬瘟(HCV)

5、、豬偽狂犬病(PRV)、豬細(xì)小病毒病(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，建立的ELISA方法有良好的特異性。間接ELISA方法的建立為試劑盒的研制與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 以純化的融合蛋白(GST-Cap)作為免疫原，通過腹部皮下注射免疫BALB/c小鼠，末次加強(qiáng)免疫后3d無菌取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，進(jìn)行HAT選擇培養(yǎng)，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩選獲得了2株分泌抗PC

6、V2 Cap蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1D2和6D8，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價分別為1：256、1：1024，小鼠腹水效價分別為1：8192、1：131072。ELISA結(jié)果顯示，1D2和6D8僅與表達(dá)的Cap蛋白反應(yīng)，而與空載體pGEX-6P-1表達(dá)的蛋白、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒不反應(yīng)。間接免疫熒光結(jié)果顯示，6D8能與PCV2發(fā)生熒光反應(yīng)，而不與PCVl發(fā)生交叉反應(yīng)，表明所獲得的6D8是PCV2型特異性的