發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染黃瓜形成轉(zhuǎn)基因毛狀根的初步研究及orf14基因的克隆.pdf

1、發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumthizogenes）侵染植物外植體能誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因毛狀根(hairyroot)。獲得的毛狀根起源于單細(xì)胞而無嵌合體,并能在無植物激素的培養(yǎng)基上自主性快速生長。毛狀根可直接作為植物根部線蟲等病蟲害的宿主;還可應(yīng)用于環(huán)境修復(fù);也可以作為生物反應(yīng)器,用于生產(chǎn)外源基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物和藥用植物的活性成分。毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的T-DNA插入、整合到植物細(xì)胞基因組中表達(dá)的結(jié)果。轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的穩(wěn)

2、定遺傳和高效表達(dá)是毛狀根具有利用價值的前提條件。
　　 本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599侵染黃瓜不同外植體獲得毛狀根,對T-DNA在毛狀根中整合的完整性進(jìn)行了分析;并對長期培養(yǎng)的毛狀根中外源基因的穩(wěn)定性及其表達(dá)進(jìn)行了分析;此外,從發(fā)根農(nóng)桿菌K599中克隆了其T-DNA上的orf14基因,構(gòu)建了pRI101-AN-orf14-gfp植物表達(dá)載體,orf14基因與gfp形成融合蛋白,便于orf14基因功能的分析。主要研究結(jié)果如下：

3、>　　 1.利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599(屬于黃瓜堿型,帶內(nèi)生質(zhì)粒pRi2659和外源質(zhì)粒pRI101-AN-gfp)侵染黃瓜不同外植體,其中活體下胚軸和上胚軸的生根效率最高,誘導(dǎo)率均達(dá)到了100％。同時獲得了較細(xì)、分枝多、生長快（Ⅰ型）,粗壯、分枝少、生長較慢（Ⅱ型）兩種不同形態(tài)的毛狀根。本研究建立了一種快捷、高效的毛狀根誘導(dǎo)方法,而且為毛狀根發(fā)生的分子機(jī)理的研究以及T-DNA整合規(guī)律與毛狀根形態(tài)相關(guān)性的研究提供了材料。
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4、.對30個獨(dú)立培養(yǎng)的毛狀根根系,進(jìn)行了PCR檢測,分析了T-DNA在毛狀根中整合的完整性。內(nèi)生質(zhì)粒pRi2659T-DNA上的11個基因orf2、orf3、orf4、orf8、roιA、roιB、roιC、roιD、roιE、orf14、cus以及外源質(zhì)粒pRI101-AN-gfpT-DNA上的外源基因gfp都插入整合到了植物基因組中。初步分析了發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因過程中T-DNA插入的完整性。
　　 3.對固體培養(yǎng)基

5、上培養(yǎng)3y的黃瓜轉(zhuǎn)gfp基因毛狀根進(jìn)行分析,由組成型啟動子35S驅(qū)動的gfp基因在轉(zhuǎn)錄水平上能正常表達(dá),而且能夠翻譯出編碼蛋白;此外,培養(yǎng)3y后的毛狀根,能擴(kuò)增出與毛狀根形態(tài)構(gòu)成有關(guān)的roι系列基因。本研究結(jié)果表明長期培養(yǎng)的毛狀根能保持其遺傳穩(wěn)定性,這為利用毛狀根長期工廠化生產(chǎn)外源基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物和藥用植物的活性成分提供了理論依據(jù)。
　　 4.從發(fā)根農(nóng)桿菌K599成功克隆了其T-DNA上的orf14基因,并構(gòu)建了pRI101-