發(fā)根農桿菌介導的植物基因轉化

1、發(fā)根農桿菌介導的植物基因轉化,發(fā)根是發(fā)根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes)感染整體植株或其某一器官、組織、單個細胞甚至原生質體后，產生的一種形態(tài)上與植物氣生根類似的根狀器官.,發(fā)根（hairy root）是什么？,什么是發(fā)根農桿菌 ?,發(fā)根農桿菌（A. rhizogenes） 來自土壤, 呈棒(桿)狀, 細胞質內有一種質粒(plasmid）, 叫誘根質粒（root inducing plasmid）, 簡稱

2、 Ri 質粒, 與發(fā)根的誘導有關. 發(fā)根農桿菌能侵染大多數雙子葉植物和少數單子葉植物 .,Ri質粒,Ri 質粒 T－DNA區(qū)和 Vir 區(qū)的兩個功能區(qū). T－DNA叫可轉移DNA區(qū), 可插入到寄主植物基因組中，其中攜帶生根基因和冠癭堿合成酶的基因.Vir 稱致病區(qū), 不插入到寄主植物基因組DNA中，但與T－DNA的轉移有關， Vir 區(qū) 缺失或突變則不能使感染的植物出現發(fā)根,,發(fā)根農桿菌誘導發(fā)狀根產生的原因?,發(fā)根農桿菌

3、感染植物傷口后，受傷的植物細胞合成特殊的小分子化合物，誘導 Ri 質粒的Vir區(qū)基因群活化；在Vir區(qū)基因表達產生的酶作用下T－DNA被切下；T－DNA轉移進細胞并整合到植物基因組DNA中；T－DNA在細胞中轉譯，使宿主植物產生發(fā)根,Ri 質粒感染過程,發(fā)狀根的特點,生長迅速激素自養(yǎng)分化程度高遺傳性狀穩(wěn)定,發(fā)根農桿菌感染植物的方法,向植物體直接注射對植物外植體進行接種感染與原生質體共培養(yǎng),含抗生素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)除菌

4、選擇生長速度較快、分枝較多的發(fā)根進行擴大培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)常在低鹽濃度的液體培養(yǎng)基中黑暗、恒溫條件下進行懸浮、振蕩培養(yǎng)，適當通入氧氣利于根的生長 .一般為每月增殖數十倍，最高可達上千倍（如天仙子發(fā)根每月增殖2500～5000倍）,發(fā)根的篩選及增殖培養(yǎng),發(fā)根的鑒定,形態(tài)學水平 ：激素自養(yǎng)，根叢生，多分枝， 多根毛，無向地性 組織水平：GUS 活性的測定或 NPTII 酶的檢測 細胞水平：冠癭堿的測定 分子水平：Southern B

5、lot, PCR等方法,影響發(fā)根農桿菌轉化的因素,1. 菌株: 常用菌株有 LBA9402，ATCC15834，R1601，TR105，A41027，A42659 等,目前超過100,000種化合物被從植物中鑒定，并以每年約4000種新化合物的速度增加.植物次生代謝物質大多具有生物活性，被用作醫(yī)藥品、化妝品、食品添加劑等,植物是自然界中最好的化工廠,植物次生代謝物的獲得,直接從野生植株中分離提取植物細胞培養(yǎng)優(yōu)點

6、：不破壞自然資源；不受季節(jié)、氣候和地域限制；不占用耕地; 缺點：植物細胞生長緩慢；次生代謝物含量低；生產能力不穩(wěn)定；難工業(yè)化植物發(fā)根培養(yǎng),對Ri質粒的敏感性：雙子葉植物 >單子葉植物，草本植物>木本植物在感染轉化的受體選擇上，傾向于將葉片、子葉、子葉柄、胚軸作為外植體 將菌株、植物、外植體進行不同的組合，會導致發(fā)根誘導率的變化,2. 植物種及外植體的種類,水溶性酚 ：乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮、兒茶酚、原兒茶酚

7、、沒食子酸、焦性沒食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚、對羥基苯酚 等，可激活Vir區(qū)基因表達光照,3. 理化因子的影響,感染前高滲處理、誘導培養(yǎng)時添加生長素等,4. 其它,影響發(fā)根培養(yǎng)及次生代謝物合成的因素,培養(yǎng)基： 基本培養(yǎng)基、碳源、氮源、pH值等植物激素：發(fā)根能在無激素培養(yǎng)基上較好生長，但外源激素的加入對其生長、形態(tài)和次生代謝物的合成均有影響前體物質誘導子： 可刺激代謝物的產生和分泌,5. 培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)法

8、進行成批培養(yǎng)或大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)兩步培養(yǎng)法兩相培養(yǎng)法反復成批培養(yǎng)補料成批培養(yǎng)6. 生物反應器發(fā)根易受剪切力傷害，且其生長迅速，密度高，供氧困難，保持低的流體壓力和高的溶氧量十分必要通氣性能良好且剪切力較小的反應器是其理想反應器,發(fā)狀根的用途,遺傳育種植物有用次生代謝產物工業(yè)化生產,丹參發(fā)根生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)技術,丹參(Salvia miltiorrhiza)是我國傳統(tǒng)中藥,具有活血化淤,通經止痛的功能.丹參中含有二類活

9、性成分: 脂溶性二萜醌類化合物和水溶性酚酸類化合物.二萜醌類化合物,如丹參酮I, 丹參酮IIA,隱丹參酮等,具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠狀動脈供血等藥理作用,是治療心血管系統(tǒng)疾病的重要藥物.酚酸類化合物,如丹酚酸A, 丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸, 原兒茶醛, 丹參素等,具有很強的抗脂質氧化、抗肝纖維化、改善尿毒癥、改善腎功能等作用。但是由于丹參有效成分在原植物根中含量低、生長周期長, 加之近年來產地環(huán)境污染和為防病蟲噴施農藥等原因