農(nóng)桿菌介導(dǎo)反義fad基因轉(zhuǎn)化大豆研究.pdf

1、大豆是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。培育高油酸大豆品種是大豆育種的重要方向之一。本研究旨在建立高效大豆子葉節(jié)再生體系及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)的反義fad基因轉(zhuǎn)化體系，獲得高頻率的轉(zhuǎn)基因大豆植株，為利用反義RNA技術(shù)創(chuàng)新高油酸大豆新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)以周豆11、S03-1和豫豆29為材料，從大豆種子消毒方法、無菌苗培養(yǎng)方法、大豆基因型和植物激素對(duì)子葉節(jié)叢生芽分化的影響等方面進(jìn)行研究，建立了一個(gè)高效的大豆器官再生體系：用10％的次氯酸鈉消毒大

2、豆種子7 min，用沙培法種子發(fā)芽率可達(dá)到100％，用0.8mg/L6-BA和0.05 mg/L IBA的激素組合使周豆11號(hào)子葉節(jié)芽誘導(dǎo)率達(dá)95.83％,每個(gè)外植體產(chǎn)生2-4個(gè)芽。芽在附加0.2mg/L IBA的MS培養(yǎng)基上，發(fā)根率可達(dá)100％。再生植株移栽成活率91％。在此大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)基礎(chǔ)上，利用根癌農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)大豆反義油酸脫飽和酶基因fad2-1轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)，研究了農(nóng)桿菌菌液OD值、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、感染時(shí)共培養(yǎng)時(shí)間

3、、恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間、pH值、乙酰丁香酮的濃度、頭孢酶素和卡那霉素等因素對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)形成叢生芽的影響，建立了有效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)反義fad2-1 轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)的體系：子葉節(jié)預(yù)培養(yǎng)2-3天，根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌液OD在0.6-0.8之間，感染16min，共培養(yǎng)2-3天，恢復(fù)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3.5天，培養(yǎng)基的pH值在5.4-5.6之間，在感染菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入100μmol/L乙酰丁香酮，叢生芽篩選培養(yǎng)基含300mg/L頭孢霉素和

4、50mg/L卡那霉素，卡那霉素抗性叢生芽誘導(dǎo)率可達(dá)30.3％，獲得卡那霉素抗性芽51個(gè)。這些抗性芽轉(zhuǎn)入含0.2mg/L6-BA和1.0mg/L IBA和50mg/L卡那霉素的生根培養(yǎng)基中生根，獲得10個(gè)卡那霉素抗性植株，轉(zhuǎn)化率為1.96％。使用35S啟動(dòng)子和nptⅡ基因特異PCR引物對(duì)10株抗性轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，其中2株擴(kuò)增出了35S啟動(dòng)子和nptⅡ基因的特異帶，大小分別為300bp和740bp，證明反義fad2-1