農(nóng)桿菌介導非抗生素標記的抗逆基因BADH轉化大豆的研究.pdf

1、大豆的生長發(fā)育受外界環(huán)境影響很大，尤其是非生物脅迫因素如干旱、鹽堿、凍害、低溫等，嚴重時會導致大幅度的減產(chǎn)甚至絕收。因此增加大豆的抗逆性是大豆改良的重要目標，同時對緩解我國大豆產(chǎn)業(yè)危機具有十分重要的意義。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，轉基因技術已經(jīng)日益成為植物耐逆育種的主要方法。
　　 本研究以浙江省杭州國家大豆改良分中心保存的‘浙春3號’、‘H0302’和‘57001’為研究材料，將抗逆基因BADH構建到非抗生素標記的植物表達

2、載體pBA002內(nèi)，并將其導入大豆基因組中表達產(chǎn)生甜菜堿醛脫氫酶。甜菜堿醛脫氫酶可以清除由于非生物脅迫而在體內(nèi)產(chǎn)生的有毒害作用的甜菜堿醛，積累大量的甜菜堿。它是一種高效的滲透調(diào)節(jié)劑，從而提高大豆的耐逆性，以期獲得具有抵抗鹽害、干旱等非生物脅迫能力的大豆新種質。隨著轉基因農(nóng)作物逐漸商品化，轉基因作物中選擇標記基因存在的生物安全性問題越來越引起人們的關注，構建一個不含抗生素類選擇標記的安全的植物表達載體，顯得尤為重要。本文擬構建含耐逆相關B

3、ADH基因且不以抗生素為篩選標記的植物表達載體，進而為獲得耐逆性增強的轉基因材料做準備。建立和優(yōu)化遺傳轉化體系是成功獲得轉基因大豆的首要前提，本實驗主要采用大豆子葉節(jié)和帶一片子葉胚芽尖作為遺傳轉化體系的外植體，并研究影響遺傳轉化的重要影響因子。主要研究成果如下:
　　 1、植物表達載體的構建。采用PCR技術擴增出甜菜堿醛脫氫酶基因BADH，并于上下游引物端分別添加Xhol和SacⅠ酶切位點和保護性堿基序列;TA克隆PCR產(chǎn)物至p

4、TA2并進行測序驗證;雙酶切經(jīng)過測序驗證的重組質粒pTA2-BADH和植物表達載體pBA002，分別回收目的基因和pBA002載體片段，并進行連接轉化，提取陽性質粒，然后進行雙酶切、PCR擴增和進一步的測序驗證。結果表明BADH基因已被完整、正確的插入到pBA002載體中，成功構建了含BADH和Bar基因的植物表達載體，為進一步的植物遺傳轉化奠定了基礎。
　　 2、農(nóng)桿菌介導的大豆子葉節(jié)遺傳轉化再生體系的優(yōu)化。本文以大豆品種‘浙

5、春3號’的子葉節(jié)為受體材料，主要研究了預培養(yǎng)時間、侵染時間、共培養(yǎng)時間、6-BA對農(nóng)桿菌介導的大豆子葉節(jié)遺傳轉化再生體系的影響。結果表明，預培養(yǎng)時間、侵染時間和共培養(yǎng)時間對子葉節(jié)叢生芽誘導率的具有較大影響。其中預培養(yǎng)時間影響尤為顯著，侵染時間和共培養(yǎng)時間影響不顯著。預培養(yǎng)時間21h，侵染時間70min，共培養(yǎng)時間為3d時，叢生芽誘導率最高為86.5％。6-BA在大豆子葉節(jié)再生系統(tǒng)恢復階段起著重要的作用。以叢生芽誘導率為指標，在恢復培養(yǎng)基

6、中添加1.5mg/L6-BA時誘導效果最好，叢生芽誘導率達到最大值88.8％。此外，我們以‘浙春3號’、‘57001’和‘H0302’為受體材料，研究了基因型的影響。結果顯示，在大豆子葉節(jié)遺傳轉化再生體系中具有顯著的基因型效應。3個基因型叢生芽誘導率差異顯著。其中‘浙春3號’叢生芽率最高，達86.68％;其次為‘57001’80.78％，最少為‘H0302’僅48.92％。
　　 3、農(nóng)桿菌介導的大豆帶一片子葉胚芽尖遺傳轉化再生