農(nóng)桿菌介導(dǎo)EPSPS抗草甘膦基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯品種.pdf

1、本研究所用外植體為馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它的脫毒微型薯，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將EPSPS抗草甘膦基因?qū)腭R鈴薯，經(jīng)PCR、PCR-Southern和Southern檢測(cè)，證明EPSPS基因已轉(zhuǎn)入馬鈴薯基因組中。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，證明EPSPS基因在馬鈴薯基因組中能夠正常轉(zhuǎn)錄。試驗(yàn)建立了高效的馬鈴薯再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化影響因素中的：激素種類與濃度、脫菌抗生素的種類與濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、篩選方式等進(jìn)行了優(yōu)化研究。通過了對(duì)抗性植株的抗

2、草甘膦測(cè)定，初步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對(duì)草甘膦表現(xiàn)出抗性。主要研究結(jié)果如下：
　　 1)確定了適宜于馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它的薯塊再生培養(yǎng)基為MS+1mg/L IAA+4mg/LZT。
　　 2)確定了農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.5，侵染時(shí)間為6 min時(shí)，薯片出芽率為72.43％，污染率為8.7%。
　　 3)共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響很大，薯片最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3d。
　　 4)對(duì)不同的脫菌抗生素的濃度進(jìn)行了

3、比較試驗(yàn)，羧芐青霉素對(duì)含EPSPS基因的農(nóng)桿菌有效抑菌濃度是450mg/L，國(guó)產(chǎn)哈藥頭孢噻肟鈉的有效抑菌濃度是450mg/L，進(jìn)口Invirogen頭孢噻肟鈉的有效抑菌濃度是150mg/L。
　　 5)試驗(yàn)采用的抗性選擇劑是草丁膦(PPT)，篩選方式為延遲5d篩選，結(jié)果表明薯片芽誘導(dǎo)階段PPT濃度為6 mg/L，生根階段的PPT濃度為4 mg/L。
　　 6)試驗(yàn)獲得抗性植株38株，經(jīng)PCR檢測(cè)有17株呈陽性，進(jìn)一步的P

4、CR-Southern雜交出現(xiàn)10株陽性信號(hào)，初步表明EPSPS基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中。隨機(jī)選取7株P(guān)CR-Southern雜交陽性植株進(jìn)行RT-PCR，有6株擴(kuò)增出陽性條帶，說明外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中能夠轉(zhuǎn)錄，最后通過Southern雜交出現(xiàn)5株陽性信號(hào)，進(jìn)一步證明了EPSPS基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中。
　　 7)對(duì)T1代5株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)，獲得陽性植株4株，并對(duì)其進(jìn)行草甘膦抗性鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)EPSPS基