農(nóng)桿菌介導(dǎo)的P5CS基因轉(zhuǎn)化東農(nóng)303馬鈴薯的研究.pdf

1、干旱、鹽堿、高溫、低溫等環(huán)境條件是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素,這些非生物因素通過滲透脅迫(osmotic stress)影響植物細(xì)胞膨壓從而導(dǎo)致植物的不良生長(zhǎng)。在滲透脅迫下,植物將產(chǎn)生一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵抗該脅迫,包括脯氨酸和甜菜堿。脯氨酸主要來源于谷氨酸合成途徑,△1-二氫吡咯-5-羧酸合成酶(△1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase,,P5CS)是脯氨酸合成的關(guān)鍵酶。為了提高我國(guó)馬鈴薯栽培品種對(duì)環(huán)境脅迫

2、的適應(yīng)能力,本論文實(shí)施了來自擬南芥的P5C$基因轉(zhuǎn)化我國(guó)馬鈴薯栽培品種東農(nóng)303的研究。
　　 首先通過不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的試驗(yàn),優(yōu)化了東農(nóng)303馬鈴薯品種的高效再分化體系;其次采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將P5CS基因轉(zhuǎn)化到馬鈴薯基因組中,并通過PCR、PCR片段BLAST、Southern blot檢測(cè),驗(yàn)證了目的基因已轉(zhuǎn)入到馬鈴薯基因組中。另外,探討了轉(zhuǎn)基因植株在干旱和鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)勢(shì)和生理生化變化。
　　 1、分別利

3、用馬鈴薯脫毒試管苗和薯塊為試驗(yàn)材料,通過吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素(ZT)、潮霉素(Hy)的不同組合優(yōu)化了遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明,最適再分化培養(yǎng)基為MS+ZT3.5mg/L+IAA.1.0mg/L,再分化條件中最適潮霉素篩選壓力為6mg/L;最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基,生根潮霉秦篩選壓力為10mg/L。
　　 2、對(duì)潮霉素抗性株系進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測(cè)。利用特異性引物進(jìn)行了PSCS基因的特異性PCR擴(kuò)增

4、,獲得了一條701bp的所需目的條帶;將所獲得的目的條帶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序、BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)目的條帶與擬南芥。P5CS基因同源性為100％;分別用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化抗性株系和未轉(zhuǎn)化株系的總DNA,通過進(jìn)一步的Southern雜交實(shí)驗(yàn),抗性株系獲得一條陽性條帶,推測(cè)P5CS基因在馬鈴薯基因組中有一個(gè)拷貝,最終獲得了一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。
　　 3、探討了轉(zhuǎn)基因株系在1.5％NaCl鹽和60％、40％、20％干旱

5、脅迫下的植株的生長(zhǎng)勢(shì)和生理生化變化。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因株系在葉片伸展度、根系的發(fā)達(dá)程度以及在結(jié)薯量上均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因株系。生理生化方面,轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫時(shí)產(chǎn)生脯氨酸的含量比未處理時(shí)增加了25倍,是未轉(zhuǎn)基因植株的1.7倍,MDA含量的增加僅為未轉(zhuǎn)基因植株的0.4倍,SOD活性則是未轉(zhuǎn)基因植株的2.6倍;在60％、40％、20％的干旱脅迫程度下,轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量分別是未轉(zhuǎn)基因植株的1.2倍、1.4倍和2.1倍,轉(zhuǎn)基因植株丙二醛含量的增加均