轉(zhuǎn)Bt融合抗蟲蛋白基因和Cp4-EPSPS抗草甘膦基因玉米轉(zhuǎn)化事件中高表達(dá)株系的篩選及分子檢測(cè).pdf

1、玉米(Zea mays L.)是世界性的糧食作物和重要的飼料作物。玉米螟(Ostriniafurnacalis H.)等農(nóng)業(yè)害蟲的為害直接影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)可以有效解決世界糧食問題，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展，因而研究如何經(jīng)濟(jì)有效的控制玉米田間病蟲害具有重要意義。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種，能夠有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，具有保護(hù)全面，有效周期長，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而成為控制玉米病蟲害的理想手段。近20年來，人們通過植

2、物轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育了一批具有抗蟲、抗病、耐除草劑等優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因玉米新品種，他們中的一部分已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，并取得了令人矚目的成就。
　　 然而，獲得一個(gè)具有商業(yè)化推廣價(jià)值的轉(zhuǎn)化株系，需要對(duì)大量的轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行篩選和鑒定，選拔出各方面性狀均較優(yōu)良的轉(zhuǎn)化株系，并對(duì)其遺傳背景、目的基因表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行透徹的研究分析，才能夠用于新品種繁育?？焖俸Y選出目的基因有效表達(dá)并穩(wěn)定遺傳的株系，是轉(zhuǎn)基因玉米從實(shí)驗(yàn)室走向產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的第

3、一步。
　　 本研究，對(duì)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的178個(gè)轉(zhuǎn)Cry1AbNJB殺蟲蛋白基因和EPSPS抗草甘膦基因的抗蟲耐除草劑玉米G3-NJB株系，進(jìn)行抗蟲生物測(cè)定、PCR分析、Western blot、Southern blot等一系列篩選檢測(cè)，得到11個(gè)抗蟲和抗除草劑基因都高表達(dá)，且目的基因單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因玉米株系;并選取了其中6個(gè)進(jìn)行T1代的抗蟲抗除草劑活性實(shí)驗(yàn)，初步探究其后代遺傳穩(wěn)定性。具體操作及結(jié)果如下:
　　

4、 (1)采用葉片飼喂法，以鱗翅目模式昆蟲棉鈴蟲(Helicoverpa armigeraH.)為供試蟲對(duì)G3-NJB進(jìn)行抗蟲活性生物測(cè)定，淘汰抗蟲能力較差的64個(gè)轉(zhuǎn)化株系;
　　 (2)將所有能收到種子的具有抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果證明44個(gè)能收到種子的轉(zhuǎn)化株系都已轉(zhuǎn)入目的基因;
　　 (3)將44個(gè)具有抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行抗蟲基因和抗除草劑基因的蛋白表達(dá)western檢測(cè)，篩選出抗蟲蛋白和抗除草劑蛋