抗除草劑草甘膦抗蟲雙抗轉(zhuǎn)基因棉花的創(chuàng)制.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文抗除草劑草甘膦抗蟲雙抗轉(zhuǎn)基因棉花的創(chuàng)制姓名：謝龍旭申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：徐培林20040518謝龍旭中山大學(xué)博士學(xué)位論文：抗除草劑草廿膦抗蟲雙抗轉(zhuǎn)基因棉花的創(chuàng)制特異性受體結(jié)合，在中腸細(xì)胞膜上形成離子通道，細(xì)胞由于滲透平衡被破壞而破裂，導(dǎo)致昆蟲最終死亡。但是由于廚基因來自于細(xì)菌，在植物中不能很好的表達(dá)。本研究采用的BtSlm基因是根據(jù)天然CryIAc和CryIAb的氨基酸序列和植物優(yōu)化密碼子的原則人工

2、合成的。啟動(dòng)BtSlm基因表達(dá)的是含有加倍增強(qiáng)子的2E一35S啟動(dòng)子。在BtSlm基因上游嵌合一段來自煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)RNA57端非翻譯區(qū)的引導(dǎo)序列f2片段，起增強(qiáng)翻譯作用。緊接BtSlm基因上游連接了一段來自煙草致病相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽伊athogenesis。relatedprotein，PRlb)編碼區(qū)序列，使表達(dá)的殺蟲蛋白分泌到細(xì)胞外。通過分子克隆技術(shù)將aroAMl2和BtSlm基因表達(dá)框

3、整合到基礎(chǔ)載體pCAMBIAl300上，構(gòu)建成植物高效表達(dá)雙元載體pAMl2Slm，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將aroAMl2和BtSlm基因?qū)氲矫藁ㄖ?，并以aroAMl2基因作為選擇標(biāo)記，直接用草甘膦進(jìn)行抗草甘膦、抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花植株的篩選。為了大量獲得轉(zhuǎn)化植株，本研究建立了棉花高效組織培養(yǎng)植株再生體系。本研究接種中棉35號、魯棉6號和石遠(yuǎn)321下胚軸外植體數(shù)分別為280、248和215塊，得到的再生棉株數(shù)為42、89和75株。對獲得的再生植株

4、進(jìn)行PCR分子檢測發(fā)現(xiàn)，所有的棉花再生植株aroAMl2基因均呈陽性，陽性率為100％。中棉35號轉(zhuǎn)化率最低，為250005％1魯棉6號轉(zhuǎn)化率最高，為806037％：石遠(yuǎn)321轉(zhuǎn)化率僅次于魯棉6號，為744O32％。攜帶有外源基因的TDNA在向棉花基因組整合過程中大約有30％的BtSlm基因丟失。Southern雜交結(jié)果顯示，在所得到的中棉35號、魯棉6號和石遠(yuǎn)321轉(zhuǎn)基因棉花中，含單拷貝的植株最多，分別為70O％、550％和650％。

5、Northern雜交中分別出現(xiàn)了13kb和19kb大小的轉(zhuǎn)錄條帶，表明aroAMl2和BtSlm基因在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行了正確的表達(dá)；Western雜交中分別出現(xiàn)了45kDa和68kDa大小的蛋白遷移條帶，表明兩個(gè)基因在棉花植株體內(nèi)進(jìn)行了正確的翻譯。檢測中發(fā)現(xiàn)，大部分多拷貝的植株在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)反而下降。對T0代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行的離體草甘膦抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)品種的轉(zhuǎn)基因棉花抗性同野生型相比，抗性提高46倍。T0代轉(zhuǎn)化植株整株草甘膦噴灑實(shí)驗(yàn)表