一種抗草甘膦基因的發(fā)現(xiàn)和抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的培育.pdf

1、草甘膦是一種廣譜滅生性除草劑，是目前世界上用量最大的除草劑。其作用機(jī)制是草甘膦抑制莽草酸途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase，EPSPS)，導(dǎo)致莽草酸合成途徑中斷，植物所必須的芳香族氨基酸不能合成，最終導(dǎo)致植物死亡。革甘膦直接使用在農(nóng)田會(huì)造成作物的傷害，甚至死亡。將抗草甘膦的EPSPS基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)培育抗草甘膦作物，就可直接在田間使用草甘膦來(lái)

2、控制雜草。 水稻是世界上最主要的糧食作物，世界上近一半人口，包括幾乎整個(gè)東亞和東南亞的人口，都以稻米為食。雜草危害是水稻減產(chǎn)的最主要原因之一。發(fā)現(xiàn)抗草甘膦基因，培育抗草甘膦水稻對(duì)提高水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和解放勞動(dòng)力具有重要的意義。 本論文從嚴(yán)重革甘膦污染的土壤中分離出一株高抗草甘膦菌株，該菌株可耐受200mM的草甘瞵濃度。通過(guò)16S rDNA和掃描電鏡分析，初步認(rèn)定為假單胞桿菌，暫命名為假單胞桿菌G6。 利用PCR方法

3、擴(kuò)增假單胞桿菌G6基因組，得到了G6基因。氨基酸序列分析表明，G6基因和ClassⅡ EPSPS同源性較高，含有EPSPS蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域、模式和保守氨基酸。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)建模顯示G6基因三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)生物信息學(xué)分析初步確定克隆到的G6基因可能具有抗草甘膦特性。 為驗(yàn)證克隆到基因具有抗草甘膦活性，將G6基因插入pET-28載體，構(gòu)建了pET-G6原核表達(dá)載體。將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中進(jìn)行草甘膦抑制下的細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明

4、在含50mM和100mM革甘膦的M63液體培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但在含150mM草甘膦的M63液體培養(yǎng)基中，細(xì)胞的生長(zhǎng)在前期受到了明顯的抑制。 驗(yàn)證了G6基因具有抗草甘膦活性，將攜帶有pET-G6質(zhì)粒的BL21(DE3)細(xì)胞進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。SDS分析表明，G6蛋白能在大腸桿菌中大量表達(dá)，蛋白質(zhì)分子量約46KDa。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行了初步的純化并制備了多克隆抗體，為以后的抗草甘膦轉(zhuǎn)基兇作物的檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。 根據(jù)水稻密碼子

5、的偏愛(ài)性，重新合成了G6基因。并在G6基因的5'端加入了葉綠體信號(hào)肽，該信號(hào)肽來(lái)源于玉米的乙酰乳酸合成酶(acetohydroxyacid　synthase)：G6基因3'端加終止子片段，終止子片段來(lái)源于玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxlase)。合成的G6基因和玉米ZmUbi-1啟動(dòng)子克隆到pCAMB1300載體中，得到了植物雙元表達(dá)載體pCAMBl300-ZmUbi-G6sy。采用農(nóng)桿

6、菌侵染法與粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)秀水11愈傷共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，對(duì)轉(zhuǎn)化得到的植株進(jìn)行了分子鑒定，結(jié)果顯示G6基因已整合進(jìn)水稻基因組中。對(duì)T0植物進(jìn)行了草甘膦敏感性測(cè)試，在噴灑稀釋50倍、25倍和16.6倍10％草甘膦水劑的情況下，生長(zhǎng)良好。對(duì)T1植物進(jìn)行了草甘膦敏感性測(cè)試，在噴灑稀釋100倍、50倍、25倍10％草甘膦水劑的情況下，生長(zhǎng)良好；在噴灑稀釋12.5倍10％草甘膦水劑的情況下，部分株系生長(zhǎng)受