新型轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米的培育及轉(zhuǎn)基因玉米安全控制技術(shù)的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因玉米是最早獲得批準(zhǔn)進行商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物之一，也是世界上種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因糧食作物。目前，種植的轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米主要是抗草甘膦玉米。事實上，及時開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新一代轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米品種，是我國玉米種子產(chǎn)業(yè)面對國外競爭和挑戰(zhàn)的唯一出路。轉(zhuǎn)基因抗草甘膦植物可以通過以下三種途徑獲得:一是在植物體內(nèi)過量表達EPSPS;二是引入能夠降解草甘膦的酶;三是在植物中表達對草甘膦不敏感的EPSPS。本研究主要是通過向玉米中導(dǎo)入對草

2、甘膦不敏感的EPSPS基因，從而獲得了對草甘膦抗性良好的轉(zhuǎn)基因玉米株系。
　　 轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種非常強大的改造生命的技術(shù)，同時存在著相當(dāng)?shù)臐撛陲L(fēng)險，所以轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的控制和識別技術(shù)變得非常重要。盡管目前對于轉(zhuǎn)基因有嚴格的監(jiān)管政策，但是依靠物理分離和隔離的控制方法，轉(zhuǎn)基因污染和意外傳播仍然時不時發(fā)生。因此，在發(fā)展轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的同時必須發(fā)展轉(zhuǎn)基因安全技術(shù)。為此，本研究在培育轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米的同時，又發(fā)明了一種可以被選擇性滅殺的

3、玉米安全轉(zhuǎn)基因控制的方法。
　　 所得主要結(jié)果如下:
　　 (1) EPSPS基因G10是本課題組獨立從微生物細菌Deinococcus radiodurans R1(GI:8469109)中發(fā)掘出來的，它是既不屬于ClassⅠ也不屬于ClassⅡ的新型抗草甘膦基因。根據(jù)玉米密碼子的偏愛性，重新合成了新的G10基因，并且利用兩個不同的組成型啟動子pZmUbi-1和p35S-actintron分別啟動該基因的表達。為了使該

4、基因成功定位到細胞葉綠體內(nèi)，在G10基因的5’端加上了一段玉米葉綠體信號肽。最終構(gòu)建好的攜帶有兩個G10基因的pCAMBI1300載體通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LB4404中。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)基因方法我們共獲得了208個轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米株系。研究中，通過PCR檢測、Southern blot、Western blot、Tail-PCR以及草甘膦抗性實驗對所獲得的轉(zhuǎn)基因株系進行了分子生物的鑒定。結(jié)果表明，在所獲得的轉(zhuǎn)基因玉米株系中株系A(chǔ)

5、nti-G-162不但對草甘膦表現(xiàn)出了高水平的抗性，而且為單拷貝株系，并且其T2代在農(nóng)藝性狀上與非轉(zhuǎn)基因玉米相比并沒有明顯的差異。該株系在浙江的試驗表明，其抗性水平至少和Monsanto的相同。因此在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物開放以后，我們研發(fā)的產(chǎn)品能夠和Monsanto的產(chǎn)品進行競爭，從而保護我國的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種業(yè)。篩選出的株系可以作為良好的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米，為下一步的玉米育種工作提供材料。
　　 (2)轉(zhuǎn)基因玉米因為異花授粉，花

6、粉飄散的距離很遠，容易造成基因漂移，如何進行安全控制一直是轉(zhuǎn)基因安全控制研究的重點。根據(jù)本課題組早期轉(zhuǎn)基因水稻的安全控制技術(shù)思路，我們也研究了一種在轉(zhuǎn)基因玉米上適用的安全控制技術(shù)。本研究中，采用RNA干擾的方法抑制玉米體內(nèi)煙嘧磺隆解毒酶基因CYP81A9的表達，從而使轉(zhuǎn)基因玉米對煙嘧磺隆敏感;同時引入一個抗草甘膦基因G10，這樣所獲得的轉(zhuǎn)基因玉米能被煙嘧磺隆選擇性殺死但對草甘膦具有抗性，而常規(guī)玉米由于本身對煙嘧磺隆不敏感所以不會受到任何

7、影響。本論文中，最終所獲得的轉(zhuǎn)基因玉米株系R450-58能被正常大田使用濃度的煙嘧磺隆殺死。上述結(jié)果表明，本研究發(fā)展的這種可被選擇性滅殺的轉(zhuǎn)基因玉米技術(shù)是非常簡單并且方便的。事實上，我們可以將任意我們所感興趣的基因?qū)氲奖狙芯克玫降腡-DNA載體骨架上，從而培育出可被選擇性控制的轉(zhuǎn)基因玉米，進而根據(jù)我們的意愿通過噴施兩種常用的除草劑輕易的選擇出或是滅殺掉轉(zhuǎn)基因玉米植株。這一技術(shù)的出現(xiàn)，將為我國發(fā)展更加安全、可靠、可控的轉(zhuǎn)基因生物提供技