轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因抗草甘膦玉米品系分子特征及特異性檢測.pdf

1、轉(zhuǎn)基因玉米是最早獲得商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物之一，也是世界上種植面積最大的轉(zhuǎn)基因經(jīng)濟(jì)、糧食作物。我國至今尚無轉(zhuǎn)基因玉米品系獲批產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，原因之一就是轉(zhuǎn)基因玉米的分子特征信息不完善，阻礙了相應(yīng)品系的安全評價(jià)工作。G2-epsps是本研究室自主克隆的抗草甘膦基因,根據(jù)植物密碼子偏好性對G2-epsps進(jìn)行優(yōu)化，獲得新型抗草甘膦基因2mG2-epsps。新型轉(zhuǎn)2mG2-epsps基因玉米在田間試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗草甘膦特性。本研究以轉(zhuǎn)2mG2

2、-epsps基因玉米品系為研究對象，利用反轉(zhuǎn)錄（RT-PCR）和高效熱不對稱交互PCR（hiTAIL-PCR）技術(shù)及分子雜交技術(shù)，分析了插入外源 T-DNA的拷貝數(shù)及側(cè)翼序列，建立了相應(yīng)玉米新品系特異性檢測方法。本研究獲得了轉(zhuǎn)基因玉米品系的分子特征信息、檢測方法，為申請安全證書以及商業(yè)化后的檢測、監(jiān)管提供有力的保障。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）利用反轉(zhuǎn)錄PCR和Western Bolt分析轉(zhuǎn)基因玉米品系D、T255、T254、T

3、257中外源基因2mG2-epsps的表達(dá)。結(jié)果表明，外源基因2mG2-epsps在轉(zhuǎn)基因玉米品系D、T255、T254、T257中正常轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的抗除草劑G2-EPSPS快速檢測試紙條檢測的結(jié)果一致。
　　（2）通過Southern Blot、微滴式數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR）測定轉(zhuǎn)基因玉米品系D、T255、T254、T257插入外源基因T-DNA拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米品系D的外

4、源基因拷貝數(shù)為2個(gè)，品系T254、T257外源基因拷貝數(shù)約為3，品系T255外源基因拷貝數(shù)約為4。因此將轉(zhuǎn)基因玉米品系D作為下一步研究的材料。
　　（3）通過3'端1次hiTAIL-PCR和1次長鏈PCR擴(kuò)增方法獲得了轉(zhuǎn)抗草甘膦基因2mG2-epsps玉米品系D的外源DNA插入片段的全DNA序列（T-DNA）及兩端側(cè)翼序列。發(fā)現(xiàn)外源插入序列共3827 bp，其中包括一個(gè)完整拷貝的2mG2-epsps基因序列，以及一個(gè)玉米泛素化啟動(dòng)

5、子ubiquitin promoter、一個(gè)完整終止子 Nos-Ter，并且外源基因2mG2-epsps的5'端還帶有葉綠體導(dǎo)肽CTP。外源T-DNA的第一個(gè)插入位點(diǎn)位于玉米基因組的Ⅰ號染色體上（227622408..227656679），第二個(gè)插入位點(diǎn)位于位于玉米基因組的Ⅱ號染色體上（113077961-113077617）。
　　（4）轉(zhuǎn)基因玉米D品系特異性檢測方法的建立。根據(jù)獲得的外源T-DNA序列與玉米基因組的連接區(qū)即側(cè)翼