發(fā)根農桿菌介導IRT1基因轉化鎘超富集植物油菜的研究.pdf

1、目的:重金屬鎘(Cd)因其致癌性強而引起業(yè)界廣泛關注，Cd可通過工業(yè)廢水、廢渣污染土壤和水源，并通過食物鏈進入到動物及人體內對生物造成不可逆的損害。隨著生物技術的不斷發(fā)展，利用植物進行Cd污染的修復顯示出良好的應用潛力。
　　自然界中存在可以富集Cd的超富集植物，能夠在一定濃度的Cd污染環(huán)境中生存，并通過新陳代謝機制攝取和固定Cd。但目前已知的Cd超富集植物存在富集系數(shù)低、富集量有限等缺點，影響了實際應用。隨著基因工程技術的發(fā)展，

2、利用基因工程的手段對Cd超富集植物進行轉基因改造，是促進Cd污染環(huán)境植物修復技術發(fā)展的重要途徑。
　　因此本論文選擇分布廣泛、易獲得的Cd超富集植物油菜(Brassica campestrisL.)進行轉基因改造研究，希望通過農桿菌介導的方法建立轉基因的油菜毛狀根體系，今后可利用轉基因毛狀根體系作為Cd富集轉基因改造研究平臺。
　　方法:利用農桿菌介導的方法對油菜進行轉基因毛狀根的誘導和基因改造研究。利用油菜種子進行無菌培養(yǎng)

3、獲得外植體，同時將發(fā)根土壤桿菌ATCC15834進行單克隆培養(yǎng)、活化，將活化好的菌液與外植體子葉外植體進行共培養(yǎng)，后轉移至含頭孢噻肟鈉(Cephalosporins，Cef)的培養(yǎng)基上進行除菌，10d后可獲得油菜毛狀根。設計引物對油菜毛狀根進行PCR檢測，檢驗rolB基因是否已整合進入植物毛狀根組織。同時對不同的侵染時間、不同濃度萘乙酸(NAA)對油菜毛狀根誘導的影響進行分析研究。
　　在確定油菜毛狀根成功獲得的基礎上，利用Tak

4、ara公司的pRI101質粒將與Cd富集相關的IRT1基因整合進ATCC15834菌種中，并利用改造過的ATCC15834浸染油菜子葉外植體，誘導獲得轉IRT1基因毛狀根。同樣設計引物利用PCR技術進行IRT1基因、rol B基因的檢驗，確定IRT1基因、rolB基因已經整合植物毛狀根組織的DNA中。
　　最后對轉IRT1基因毛狀根進行Cd富集實驗研究。將轉IRT1基因油菜毛狀根與野生菌誘導的油菜毛狀根分別置于含不同濃度Cd的培養(yǎng)

5、基上進行暗培養(yǎng)。7d和14d分別取樣進行生物量、毛狀根富集的Cd含量、培養(yǎng)基殘留Cd含量的測定，探討轉入IRT1基因提高油菜毛狀根富集Cd的可能性。
　　結果:設計引物對油菜毛狀根進行PCR檢測，可以檢測到大小為423bp的rolB基因條帶，確定發(fā)根農桿菌Ri質粒中的rolB基因已整合進入植物毛狀根組織DNA中。目前未見有文獻報道油菜毛狀根的成功誘導。不同的侵染時間對毛狀根的誘導有著較明顯的影響，在一定范圍的侵染時間內，毛狀根的誘

6、導率呈正態(tài)分布，其中侵染時間為4h時，毛狀根的誘導率最高;在培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA也能不同程度地促進油菜毛狀根的生長，在0～1.0mg/L的范圍內，NAA濃度越高，油菜毛狀根誘導率越高。
　　重組質粒IRT1-pRI101經測序后證明構建成功。經轉化重組質粒IRT1-pRI101獲得的重組菌ATCC15834侵染油菜子葉外植體獲得轉IRT1毛狀根，設計引物進行IRT1基因、rolB基因的PCR檢測，實驗結果表明毛狀根DNA中

7、存在423bp、471bp大小條帶，證明rolB基因、IRT1基因已經整合進入植物毛狀根組織。
　　Cd富集實驗結果表明，野生型和轉IRT1油菜毛狀根都能有效地富集培養(yǎng)基中的Cd。在不同濃度的Cd環(huán)境下，轉入了IRT1基因的毛狀根比野生型毛狀根的生長狀況更好，對Cd的富集量更高。隨著培養(yǎng)基中Cd濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，轉IRT1油菜毛狀根對Cd的富集量也隨之增加。在100μmol/LCd培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后，轉IRT1基因毛狀