用發(fā)根農(nóng)桿菌介導轉化的方法探究木豆耐鋁基因的特性.pdf

1、在亞洲國家中酸性土壤中，豆類作物的栽培非常普遍，豆類作物是這些國家人口糧食的主要蛋白源，而在酸性土壤中，過量的質(zhì)子和過量的鋁造成的根際鋁毒是豆類作物低產(chǎn)的主要原因，也是酸性土壤最常見的問題。為了探究豆類作物中的耐鋁基因的功能，通過轉基因技術，提高豆類作物的耐鋁特性，本研究開發(fā)了一個高效的發(fā)根轉化系統(tǒng)，這個方法可用于表征基因功能，調(diào)節(jié)脈沖作物的耐鋁性。
　　1.建立高效的土壤農(nóng)桿菌介導煙草葉片產(chǎn)生根狀毛系統(tǒng)。利用發(fā)根土壤農(nóng)桿菌侵染煙

2、草葉片，將土壤農(nóng)桿菌中的重要遺傳信息轉導到煙草的根狀毛中，其高效轉導的成功率是整個研究的關鍵。通過插入攜帶待研究的目的基因克隆到T-DNA上，通過電穿孔技術將攜帶目的基因的T-DNA插入土壤農(nóng)桿菌中，隨后通過介導轉化，土壤農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)粒會與攜帶目的基因的T-DNA共同進入煙草葉片產(chǎn)生的根狀毛中。本研究的結果表明，利用土壤農(nóng)桿菌攜帶三種不同的目的基因介導野生型煙草和NtSTOP1突變體煙草葉片得到根毛的概率在80％以上，目的基因插入根

3、毛的概率在90％以上。
　　2.得到高效的根毛轉化系統(tǒng)后，為了進一步驗證使用土壤農(nóng)桿菌介導煙草根狀毛與煙草植株的根系是否在生理功能上一致，通過使用兩種不同形狀的煙草作為介導轉化的宿主進行實驗，測定通過土壤農(nóng)桿菌介導轉化后的煙草的根毛的耐鋁基因的遺傳信息和有機酸分泌的情況，研究結果表明，通過土壤農(nóng)桿菌介導野生型煙草和NtSTOP1突變體煙草葉片形成的根狀毛的有機酸分泌水平和NtSTOP1，NtMATE, NtALS3的表達量信息與前

4、人使用這兩種性狀的煙草植株實驗得到的結果一致，即NtSTOP1突變體煙草根毛沒有分泌有機酸的功能，在無論是否有鋁脅迫的情況下，NtSTOP1和關聯(lián)基因NtMATE和NtALS3的表達量水平都很低。
　　3.高效穩(wěn)定的煙草根狀毛系統(tǒng)的應用。在木豆(Cajanus cajan(L.)中克隆得到MATE（多藥有毒化合物排出）基因并用綠色熒光蛋白進行細胞融合，標記CcMATE1∷ sGFP,在載體pBEAB中表達后通過電穿孔技術將其插入土

5、壤農(nóng)桿菌中的迷你Ti質(zhì)粒中，隨后通過土壤農(nóng)桿菌介導NtSTOP1突變體煙草葉片得到根狀毛，通過進行觀察綠色熒光蛋白的煙草根狀毛來篩選轉導成功的煙草根狀毛來進行后續(xù)的研究。通過綠色熒光顯微鏡觀察得到CcMATE1在根尖細胞膜的細胞質(zhì)膜上表達。原本沒有耐鋁功能的NtSTOP1突變體煙草根狀毛，通過農(nóng)桿菌介導轉化后攜帶CcMATE1基因的NtSTOP1突變體煙草根狀毛根尖有機酸分泌量是對照實驗有機酸分泌量的4倍。
　　綜上所述，通過土壤