轉gshB基因油菜毛狀根的誘導.pdf

1、目的：重金屬鎘(Cd)是生物毒性較強的重金屬元素之一，它會隨工業(yè)“三廢”排放到土壤中，并且在土壤一植物系統(tǒng)中遷移，因此Cd污染土壤的修復引起了世界各國的關注。利用植物修復技術進行Cd污染土壤的修復具有良好的應用潛力，而Cd超富集植物是這一技術應用的關鍵。因此加強對Cd超富集植物的研究是推動植物修復Cd污染環(huán)境實際應用的基礎。本文選擇生長快、易獲得的Cd超富集植物油菜（Brassica campestris L.）作為研究材料，選擇編碼谷

2、酰半胱氨酸巰基合成酶(GS)的gshB基因作為外源目的基因，希望利用農桿菌介導技術建立轉基因的油菜毛狀根體系，為研究植物根系與Cd的相互作用提供簡便可靠的實驗體系。
　　方法：發(fā)根農桿菌介導法是植物轉基因技術常用的方法之一，利用野生型發(fā)根農桿菌和攜帶gshB基因的發(fā)根農桿菌分別轉化油菜，獲得野生型油菜毛狀根和轉gshB基因油菜毛狀根。為了實現(xiàn)油菜毛狀根的誘導并獲得較高的轉化率，利用正交試驗(L8(27))的方法，考查了發(fā)根農桿菌菌

3、種(ATCC11325、ATCC15834)、油菜外植體（子葉、莖段）、侵染時間(10 min、30 min)、激素（2，4-D、NAA）四因素對油菜毛狀根誘導的影響。利用熱激法將構建的重組pRI101-gshB質粒轉入發(fā)根農桿菌ATCC11325中，獲得改造的含有gshB目的基因的ATCC11325菌種。利用PCR和RT-PCR技術對轉化的毛狀根進行鑒定，確定毛狀根轉化的關鍵基因rolC和目的基因gshB已經整合到油菜毛狀根組織的DN

4、A中。對油菜毛狀根進行初步的Cd脅迫應激響應研究。將轉gshB基因毛狀根和野生型毛狀根分別置于不含Cd和含50μmol/L Cd的MS培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)，7d后取樣測定毛狀根的生物量、毛狀根中過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化、丙二醛(MDA)的含量，并且通過PI染色檢測Cd脅迫下的植物細胞膜的通透性。
　　結果：正交實驗方差分析結果顯示，菌種和侵染時間的交互作用、外植體種類對油菜毛狀根的誘導達到顯著水平。正

5、交實驗結果表明:利用發(fā)根農桿菌ATCC11325對預培養(yǎng)48 h的油菜子葉進行轉化，轉化時間10 min，同時加入0.3 mg/L的2，4-D激素時，油菜毛狀根的轉化率可達到73％。PCR擴增結果顯示發(fā)根農桿菌Ri質粒中的rolC基因已經插入并整合到油菜的植物基因組中，表明成功誘導出了油菜毛狀根體系。利用正交試驗優(yōu)化獲得的油菜毛狀根最佳誘導條件，用含有重組pRI101-gshB質粒的發(fā)根農桿菌ATCC11325侵染油菜子葉，誘導出了轉g

6、shB基因的油菜毛狀根。PCR結果表明轉gshB基因毛狀根DNA基因組中含有960 bp左右的gshB基因片段，證明目的片段已經整合到油菜核基因組中。采用RT-PCR反轉錄油菜RNA獲得cDNA序列，PCR結果顯示cDNA序列中含有960 bp的目的片段，表明目的基因已經在毛狀根中轉錄，說明成功獲得了轉gshB基因的油菜毛狀根。
　　結論：毛狀根的Cd脅迫應激響應的實驗表明，50μmol/L的Cd對油菜野生型毛狀根和轉gshB毛狀

7、根的生長都有一定的抑制作用;油菜野生型毛狀根和轉gshB毛狀根中SOD、POD酶的活性都有一定程度的升高，MDA的含量都增大，PI染色程度加深。同時，在50μmol/L的Cd處理下，轉gshB毛狀根中SOD和POD酶活性的升高比例高于野生型毛狀根，MDA的量和PI染色程度都低于野生型毛狀根。這可能是由于轉入的gshB基因提高了油菜毛狀根螯合Cd的能力，減輕了毛狀根被Cd毒害的程度。轉gshB基因油菜毛狀根體系的建立，可為后續(xù)利用油菜毛狀