轉(zhuǎn)IRT1基因龍葵毛狀根體系的建立及其對(duì)鎘脅迫響應(yīng)的初步探討.pdf

1、目的:
　　自然界中存在能夠富集鎘(Cd)的超富集植物，這種植物可以通過(guò)新陳代謝機(jī)制攝取和固定環(huán)境中的Cd，從而在一定限度的Cd污染環(huán)境中得以生存。但目前已知的Cd超富集植物普遍存在富集量有限和富集系數(shù)低等缺點(diǎn)，影響了推廣和應(yīng)用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因工程的手段對(duì)Cd超富集植物進(jìn)行基因改造，是實(shí)現(xiàn)Cd污染環(huán)境植物修復(fù)實(shí)際應(yīng)用的有效方法。
　　本研究選擇了分布廣泛、易獲得的Cd超富集植物龍葵(Solanum nigru

2、m L.)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造研究，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法建立轉(zhuǎn)IRT1基因的龍葵毛狀根體系，對(duì)轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根富集Cd的效果和可能的機(jī)制進(jìn)行探討，希望為轉(zhuǎn)IRT1龍葵植株的再生和應(yīng)用提供可靠的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　論文首先選取龍葵、油菜、芥菜3種Cd超富集植物進(jìn)行毛狀根的誘導(dǎo)，通過(guò)對(duì)3種植物毛狀根組織富集Cd的能力和機(jī)制的初步研究，確定進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造的目標(biāo)植物為龍葵。然后對(duì)龍葵毛狀根的誘導(dǎo)條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，考查不同發(fā)

3、根農(nóng)桿菌菌種、預(yù)培養(yǎng)時(shí)激素萘乙酸(NAA)濃度、不同的外植體來(lái)源、不同的外植體類型對(duì)龍葵毛狀根誘導(dǎo)的影響。
　　在對(duì)龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用Takara公司的pRI101質(zhì)粒將與Cd富集相關(guān)的IRT1基因整合進(jìn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834中，并利用改造過(guò)的轉(zhuǎn)IRT1-ATCC15834菌液侵染龍葵葉片外植體，誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根。建立起穩(wěn)定的轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根液體懸浮培養(yǎng)體系后，利用PCR技術(shù)進(jìn)行IRT

4、1基因、rolB基因的檢驗(yàn)，確定IRT1基因、rolB基因已經(jīng)整合到植物毛狀根組織的DNA中;利用Western blot技術(shù)進(jìn)行目的蛋白的檢驗(yàn)，確定IRT1基因的蛋白表達(dá)情況。
　　最后對(duì)轉(zhuǎn)IRT1基因毛狀根進(jìn)行Cd富集實(shí)驗(yàn)研究。將轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根分別置于含不同濃度Cd的培養(yǎng)液中進(jìn)行暗培養(yǎng)。14d后取樣進(jìn)行毛狀根生長(zhǎng)狀態(tài)、生物量、Cd含量、ROS（活性氧，Reactive Oxygen Species）積累

5、情況、細(xì)胞凋亡情況、抗氧化酶系統(tǒng)活性、IRT1蛋白表達(dá)情況的分析和比較，探討轉(zhuǎn)入IRT1基因?qū)μ岣啐埧珷罡褪蹸d能力的影響。
　　結(jié)果:
　　根據(jù)龍葵、油菜和芥菜三種植物的毛狀根誘導(dǎo)生根率、毛狀根液體懸浮培養(yǎng)體系建立后毛狀根的生長(zhǎng)狀況、毛狀根組織富集Cd能力的比較，發(fā)現(xiàn)龍葵毛狀根生物量大、富集Cd的能力較好，在Cd濃度為100μmol/L的條件下培養(yǎng)14d后鮮重可達(dá)2.897 g，毛狀根中的Cd含量可達(dá)745.023μg

6、/g，是適合用于進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改造的目標(biāo)植物。對(duì)龍葵毛狀根誘導(dǎo)條件優(yōu)化的結(jié)果表明，利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834侵染生長(zhǎng)3周的龍葵無(wú)菌苗外植體葉片(預(yù)培養(yǎng)NAA濃度為0.6mg/L)，毛狀根的誘導(dǎo)效果最好，此條件下生根率達(dá)90％以上。
　　利用含IRT1基因的重組菌ATCC15834侵染龍葵葉片外植體獲得了轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根，rol B、IRT1基因的PCR檢測(cè)結(jié)果表明毛狀根DNA中存在423 bp、1044bp大小條帶，證

7、明rolB基因、IRT1基因已經(jīng)整合進(jìn)入龍葵毛狀根組織。Western blot技術(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IRT1基因目的蛋白已有表達(dá)。
　　Cd脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在無(wú)Cd處理的對(duì)照條件下，轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根與未轉(zhuǎn)入IRT1的野生型龍葵毛狀根在各方面評(píng)價(jià)指標(biāo)中均無(wú)明顯差異;隨著培養(yǎng)液中Cd濃度的升高，野生型和轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根都能有效地耐受高濃度Cd的脅迫作用，但轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根的耐受能力優(yōu)于野生龍葵毛狀根。在不同Cd濃度下，轉(zhuǎn)IRT1

8、龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根相比，褐化程度都較小，生長(zhǎng)狀態(tài)更好。在含100μmol/LCd的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14d后，與未經(jīng)Cd處理的對(duì)照組毛狀根相比，野生型龍葵毛狀根鮮重減少了26.2％，干重減少了18.0％;而轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根在含100μmol/LCd的培養(yǎng)液中培養(yǎng)14d后，與未經(jīng)Cd處理的轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根相比鮮重僅減少了6.0％，干重減少了2.5％，對(duì)比可知，轉(zhuǎn)入IRT1基因的龍葵毛狀根生物量受Cd毒害作用的影響較小。從Cd的

9、富集量來(lái)看，在Cd濃度為100μmol/L的條件下，轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根和野生型龍葵毛狀根中Cd的富集量分別為886.759μg/g和745.023μg/g，表明轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根表現(xiàn)出更優(yōu)的Cd富集效果。并且在Cd脅迫下，轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根比野生型龍葵毛狀根的抗氧化酶活性(CAT、SOD、POD)更強(qiáng)，IRT1蛋白表達(dá)量高;而ROS積累程度和細(xì)胞凋亡程度比野生型毛狀根小，說(shuō)明轉(zhuǎn)IRT1龍葵毛狀根比野生型龍葵毛狀根細(xì)胞受損傷的程度小