地黃毛狀根誘導(dǎo)體系的建立及毛蕊花糖苷合成關(guān)鍵基因的鑒定.pdf

1、本文建立了地黃毛狀根誘導(dǎo)體系，通過(guò)添加誘導(dǎo)子，測(cè)定毛蕊花糖苷含量，篩選出能促進(jìn)地黃毛狀根毛蕊花糖苷合成的誘導(dǎo)子。結(jié)合RNA-Seq技術(shù)，對(duì)地黃毛蕊花糖苷生物合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選鑒定，并對(duì)地黃MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了鑒定，分析它們?cè)诘攸S不同發(fā)育時(shí)期、遮陰、連作條件下的表達(dá)情況，為毛蕊花糖苷合成途徑的分子機(jī)制的研究提供依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　1.利用不同農(nóng)桿菌和不同地黃品種誘導(dǎo)出了毛狀根，經(jīng)PCR分析證實(shí)農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒含有rolB和r

2、olC基因序列的DNA已經(jīng)整合到地黃毛狀根中，表明已轉(zhuǎn)化成功，并確定了發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060(A4)是毛狀根誘導(dǎo)效率最高的菌種，且其對(duì)不同品種的地黃誘導(dǎo)效果存在差異，對(duì)BJ-3和85-5的誘導(dǎo)效率較高，對(duì)BZY的誘導(dǎo)效率最低。
　　2.根據(jù)轉(zhuǎn)化毛狀根株系85-5-A4-1、BJ-3-A4-1在液體培養(yǎng)基中的生物量的增長(zhǎng)規(guī)律確定地黃毛狀根液體培養(yǎng)時(shí)間為30d。毛狀根在WP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率最高。比較了不同濃度的水楊酸（SA）、茉

3、莉酸甲酯（MeJA）、銀離子（Ag+）、腐胺（Put）對(duì)85-5-A4-1的生物量和毛蕊花糖苷含量的影響，結(jié)果25μmol/L的SA的效果最好，既能明顯促進(jìn)毛狀根的生長(zhǎng)，又能顯著提高毛蕊花糖苷的含量。比較了由A4誘導(dǎo)的5個(gè)品種地黃毛狀根毛蕊花糖苷含量，結(jié)果表明，BZY含量最低，SDZ含量最高，是BZY的2.8倍。QH-1和85-5毛狀根含量近似，略低于BZY，略高于BJ-3。
　　3.采用RNA-Seq對(duì)25μmol/L SA誘導(dǎo)

4、0h、12h、24h的地黃毛狀根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)SA12樣品相對(duì)于SA0有2140個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，有1576個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。SA24樣品相對(duì)于SA0有2401個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，有1617個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。SA24樣品相對(duì)于SA12有1472個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，有1246個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。在3種比對(duì)方案中均呈差異表達(dá)的基因共有272個(gè)。GO功能顯著性富集分析將3種對(duì)比方案中差異表達(dá)基因注釋到三大功能條目：生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能。其中，參

5、與代謝過(guò)程、結(jié)合及催化活性的差異表達(dá)基因最多。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)富集到的15個(gè)差異最顯著的通路中，3種對(duì)比方案中與苯丙素類(lèi)合成途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因均占總基因數(shù)的2.24％。鑒定出PAL、C4H、C3H、TyDC/DODC、CuAO、TyHO、ALDH7種可能參與毛蕊花糖苷生物合成的催化酶基因cDNA片段。qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明不同關(guān)鍵酶基因響應(yīng)SA及其它3種誘導(dǎo)子的表達(dá)模式有顯著差異。
　　4.鑒定了40個(gè)具有完整ORF的地黃

6、MYB基因。以Batch CD（CDD）搜索軟件和SMART軟件進(jìn)行分析，確認(rèn)40條具有完整ORF的序列均為MYB基因cDNA，提交到NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，注冊(cè)號(hào)KR780077-KR780116。在NCBI上進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)36個(gè)MYB基因與植物芝麻MYB的序列一致性最高，3個(gè)MYB基因與植物丹參同源蛋白的序列一致性最高，1個(gè)MYB基因與黃芩同源蛋白的序列一致性最高。以RNA-seq檢測(cè)了40個(gè)MYB基因在不同條件下表達(dá)情

7、況。其在地黃葉片和塊根中的表達(dá)量，17個(gè)RgMYB基因在葉片中表達(dá)量較塊根中高，23個(gè)RgMYB在塊根中表達(dá)量較高。遮陰后，在葉片中有28個(gè)MYB基因的表達(dá)量不同程度上調(diào)，12個(gè)基因的表達(dá)量不同程度下調(diào)；而在塊根中有21個(gè)MYB基因上調(diào)，19個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。苗期連作地黃塊根中有27個(gè)MYB基因下調(diào)表達(dá)。在拉線期連作地黃塊根中卻有28個(gè)基因上調(diào)表達(dá)。而在塊根膨大初期，超過(guò)80%的MYB基因下調(diào)表達(dá)。
　　5.qRT-PCR檢測(cè)了3