甜葉菊毛狀根培養(yǎng)體系的建立及綠原酸類化合物的積累研究.pdf

1、甜葉菊(Stevia rebaudianum Bertoni)是我國(guó)80年代初從國(guó)外引進(jìn)的一種農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，其葉片中有很高含量的二萜類物質(zhì)—甜菊糖苷，甜度高、熱量低且有許多生物活性，因而引起了學(xué)者們廣泛的關(guān)注，目前已在我國(guó)廣為栽培。除甜菊糖苷外，甜葉菊葉片中還含有多酚、黃酮、三萜、生物堿、甾醇等多種活性成分，在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)有很好的應(yīng)用前景，但由于含量不太高且難于在提取甜菊糖苷的同時(shí)進(jìn)行分離純化，因而尚未引起人們的重視。本文基

2、于現(xiàn)代植物生物技術(shù)，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法成功誘導(dǎo)出了甜葉菊毛狀根，通過PCR方法對(duì)毛狀根進(jìn)行了鑒定，并利用HPLC-MS和HPLC技術(shù)鑒定了毛狀根中主要成分—綠原酸類化合物；在此基礎(chǔ)上，以綠原酸類化合物產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化了毛狀根主要培養(yǎng)條件，建立了穩(wěn)定的甜葉菊毛狀根培養(yǎng)技術(shù)體系，為毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸類化合物提供了理論參考。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、毛狀根的誘導(dǎo)和鑒定；以發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和甜葉菊無菌葉片為研究材料，采用共

3、培養(yǎng)法誘導(dǎo)毛狀根。在侵染后第三周，甜葉菊葉片上有白色的不定根長(zhǎng)出；將經(jīng)過除菌后的不定根接種于無外源激素的1/2MS固體培養(yǎng)基，其生長(zhǎng)迅速，形態(tài)上表現(xiàn)出多分枝、無向地性等明顯的毛狀根特征，初步判斷為毛狀根。進(jìn)一步的基因檢測(cè)結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的rolB和rolC基因已成功地轉(zhuǎn)導(dǎo)至甜葉菊基因組中，毛狀根為農(nóng)桿菌侵染甜葉菊葉片所致。選取生長(zhǎng)迅速的毛狀根，接種于1/2MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，初步建立了毛狀根液體培養(yǎng)技術(shù)體系。

4、r>　　2、毛狀根中主要次生代謝物的定性定量分析；選取1/2MS液體培養(yǎng)基中收獲的毛狀根，采用70％乙醇進(jìn)行超聲輔助提取，提取物采用HPLC-MS和HPLC技術(shù)進(jìn)行定性定量分析。從HPLC譜圖來看，毛狀根提取物中主要有三個(gè)液相峰；進(jìn)一步的HPLC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，其分子離子峰的質(zhì)荷比分別為353、515和515，推定其分子式可能為C16H18O9和C25H24O12；經(jīng)過與相關(guān)參考文獻(xiàn)的比對(duì)分析，初步推斷其分別為綠原酸和二咖啡?？鼘幩?/p>

5、。在以上檢測(cè)分析的基礎(chǔ)，進(jìn)一步進(jìn)行HPLC鑒定，將其相對(duì)保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精確對(duì)比，并進(jìn)行加標(biāo)檢測(cè)分析，最終分別被確定為綠原酸(CGA)、3,5-二咖啡酰奎寧酸(3,5-CQA)和4,5-二咖啡?？鼘幩?4,5-CQA)。在此基礎(chǔ)上，建立了同步測(cè)定三種化合物的HPLC分析方法，并對(duì)三種成分進(jìn)行定量分析。
　　3、優(yōu)良毛狀根根系的篩選；挑選8個(gè)生長(zhǎng)速度較快的單克隆根系進(jìn)行繼代和擴(kuò)培，經(jīng)PCR檢測(cè)確定均為毛狀根，以產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩

6、選高產(chǎn)綠原酸類化合物的優(yōu)良根系。經(jīng)過24d培養(yǎng)，T3根系的生物量和綠原酸類化合物含量均最高，收獲的濕重和干重分別為15.23和1.54g/100mL，綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡?？鼘幩岬暮糠謩e為39.41、48.10和3.51mg/g，三種綠原酸類化合物的總產(chǎn)量高達(dá)140.36mg/100mL，因此優(yōu)選T3根系進(jìn)行后續(xù)研究。
　　4、毛狀根主要培養(yǎng)條件的優(yōu)化；以綠原酸類化合物產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了碳源種類、培

7、養(yǎng)基種類和碳源添加量對(duì)毛狀根生長(zhǎng)和綠原酸類化合物積累的影響。結(jié)果表明，B5+40g/L蔗糖最適合綠原酸類化合物的積累，在此培養(yǎng)條件下，毛狀根收獲的濕重和干重分別為17.93和2.34mg/100mL，綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩岷?,5-二咖啡酰奎寧酸的含量分別為39.44、57.72和2.48mg/g，總綠原酸類化合物的產(chǎn)量高達(dá)233.54mg/100mL，比未優(yōu)化條件前的總產(chǎn)量提高了66.39%。
　　5、甜葉菊毛狀根培養(yǎng)生

8、產(chǎn)綠原酸類化合物體系的建立；在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，研究了毛狀根動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)特征及綠原酸類化合物積累規(guī)律。結(jié)果表明，第10d為最佳繼代時(shí)間，第27d為最佳收獲時(shí)間；優(yōu)化條件下毛狀根中綠原酸類化合物產(chǎn)量高達(dá)234.40mg/100mL。
　　綜上所述，利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1轉(zhuǎn)化甜葉菊葉片，可獲得甜葉菊毛狀根，篩選優(yōu)良根系和優(yōu)化培養(yǎng)條件可大幅提高毛狀根中綠原酸類化合物的產(chǎn)量，通過甜葉菊毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸類化合物具有很好的應(yīng)用前景。本研究為毛