黃芪毛狀根培養(yǎng)體系的優(yōu)化及其主要活性成分生物合成的誘導(dǎo)調(diào)控研究.pdf

1、黃芪是黑龍江省極具發(fā)展和應(yīng)用前景的大宗林下藥用植物資源，通常以3-5年所采收的干燥根入藥，由于多年的濫采濫挖，黑龍江省的野生黃芪資源已瀕臨滅絕，而黃芪栽培種的品質(zhì)退化以及皂苷和異黃酮類有效成分含量易受環(huán)境變化和病蟲害等影響，已造成它們質(zhì)量下降和臨床治療效果不佳等不良后果。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用次生代謝活性成分并闡明其生物合成機(jī)制，現(xiàn)已成為現(xiàn)代林業(yè)生物制劑和森林植物次生代謝工程研究的重要內(nèi)容。本研究優(yōu)化并建立了一個高效快速的黃芪毛狀

2、根體外誘導(dǎo)體系，系統(tǒng)篩選出了高產(chǎn)皂苷和異黃酮類活性成分的毛狀根株系，并通過PCR分析實現(xiàn)對其分子鑒定。同時利用相關(guān)數(shù)理統(tǒng)計實驗設(shè)計和動力學(xué)模型，系統(tǒng)優(yōu)化了黃芪毛狀根的液體培養(yǎng)條件，并對其中皂苷和異黃酮次生代謝活性成分進(jìn)行了LC-MS/MS定性和定量分析檢測。通過外源理化和生物誘導(dǎo)子脅迫處理黃芪毛狀根培養(yǎng)體系，利用LC-MS/MS技術(shù)分析誘導(dǎo)處理前后黃芪毛狀根中皂苷和異黃酮類活性成分含量的變化規(guī)律，并結(jié)合qRT-PCR技術(shù)分析誘導(dǎo)處理前后

3、黃芪毛狀根中皂苷和異黃酮生物合成酶基因的表達(dá)差異性規(guī)律，最終初步闡明黃芪中皂苷和異黃酮類次生代謝活性成分生物合成路徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶基因。本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、優(yōu)化黃芪毛狀根培養(yǎng)體系高效生產(chǎn)皂苷和異黃酮類次生代謝活性成分
　　(1)選取3周齡黃芪無菌苗葉片作為外植體，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402侵染后在含有100μM乙酰丁香酮濃度的MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)移到含500 mg/L頭孢噻肟鈉濃度的抑菌培養(yǎng)基

4、中培養(yǎng)，最終能夠達(dá)到66.84％的毛狀根誘導(dǎo)率，而且整個誘導(dǎo)周期只需13天。以毛狀根生長量和次生代謝活性成分積累量為考察指標(biāo)，篩選得到高產(chǎn)皂苷的毛狀根株系A(chǔ)MHRLⅥ和高產(chǎn)異黃酮的毛狀根株系A(chǔ)MHRLⅡ，并進(jìn)行了PCR分子鑒定。
　　(2)利用CCD實驗設(shè)計和Slogistic動力學(xué)模型對高產(chǎn)皂苷的黃芪毛狀根株系A(chǔ)MHRLⅥ液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，得到最佳液體培養(yǎng)條件如下:培養(yǎng)溫度27.8℃C，接種量1.54％，蔗糖濃度3.

5、24％和培養(yǎng)時間36天。利用BBD實驗設(shè)計對高產(chǎn)異黃酮的黃芪毛狀根株系A(chǔ)MHRLⅡ液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，得到最佳液體培養(yǎng)條件如下:培養(yǎng)溫度27.8℃C，接種量1.44％，蔗糖濃度3.39％和培養(yǎng)時間34天。利用LC-MS/MS對黃芪毛狀根中的6種皂苷類單體成分和5種異黃酮類單體成分進(jìn)行了定性和定量分析。在最佳培養(yǎng)條件下，黃芪毛狀根培養(yǎng)體系中總皂苷(2.657±0.088 mg/g DW)和總異黃酮(234.77±4.27μg/g

6、 DW)產(chǎn)率，明顯高于3年生栽培黃芪中的總皂苷(2.435±0.093 mg/g DW)和總異黃酮產(chǎn)率(187.38±7.25μg/g DW)。
　　2、植物信號分子對黃芪毛狀根培養(yǎng)體系中皂苷和異黃酮生物合成的誘導(dǎo)調(diào)控
　　(1)利用茉莉酸甲酯(MJ)、乙酰水楊酸(ASA)和水楊酸(SA)信號分子對黃芪毛狀根中皂苷和異黃酮類次生代謝活性成分的生物合成進(jìn)行了誘導(dǎo)調(diào)控。誘導(dǎo)實驗策略結(jié)果表明MJ對生長處于平臺期的黃芪毛狀根(34日

7、齡)中次生代謝活性成分的生物合成誘導(dǎo)效果最佳。利用CCD實驗設(shè)計優(yōu)化并確定了最佳MJ誘導(dǎo)條件。MJ誘導(dǎo)增強(qiáng)34日齡黃芪毛狀根培養(yǎng)體系Ⅵ生產(chǎn)皂苷的最佳條件為:MJ濃度157.4μM和誘導(dǎo)時間18.4 h。在此條件下總皂苷得率為5.547±0.133 mg/g DW，是未處理空白對照組中總皂苷得率(2.685±0.051mg/g DW)的2.07倍。MJ誘導(dǎo)增強(qiáng)34日齡黃芪毛狀根培養(yǎng)體系Ⅱ生產(chǎn)異黃酮的最佳條件為:MJ濃度283μM和誘導(dǎo)時間

8、33.75 h。在此條件下總異黃酮得率為2250.10±71.88μg/gDW，是未處理空白對照組中總異黃酮得率(231.64±6.51μg/g DW)的9.71倍。
　　(2)通過qRT-PCR分析皂苷和異黃酮生物合成路徑中19個酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并結(jié)合LC-MS/MS分析皂苷和異黃酮類活性成分含量的變化規(guī)律，初步闡明了MJ誘導(dǎo)調(diào)控皂苷和異黃酮生物合成路徑中的關(guān)鍵酶基因。實驗結(jié)果表明MVD、IDI、FP和SS是MJ誘導(dǎo)調(diào)控黃

9、芪皂苷生物合成路徑中的關(guān)鍵酶基因;CH和IFS是MJ誘導(dǎo)調(diào)控黃芪異黃酮生物合成路徑中的關(guān)鍵酶基因。此外，MJ誘導(dǎo)后黃芪毛狀根培養(yǎng)體系中抗氧化酶的活力以及提取物的抗氧化活性顯著增強(qiáng)，確定了黃芪毛狀根對MJ誘導(dǎo)表現(xiàn)出了顯著的氧化應(yīng)激防御響應(yīng)。
　　3、UV輻射對黃芪毛狀根培養(yǎng)體系中皂苷和異黃酮生物合成的誘導(dǎo)調(diào)控
　　(1)利用UV-A、UV-B和UV-C對黃芪毛狀根中皂苷和異黃酮類次生代謝活性成分的生物合成進(jìn)行了誘導(dǎo)調(diào)控，實驗結(jié)

10、果表明UV-B對這兩種次生代謝活性成分的生物合成誘導(dǎo)調(diào)控效果最好。UV-B誘導(dǎo)32日齡黃芪毛狀根培養(yǎng)體系Ⅵ生產(chǎn)皂苷的最佳輻射劑量為54 kJ/m2，在此條件下總皂苷得率為3.431±0.092 mg/g DW，是未處理空白對照組中總皂苷得率(2.645±0.073 mg/g DW)的1.30倍。UV-B誘導(dǎo)增強(qiáng)34日齡黃芪毛狀根培養(yǎng)體系Ⅱ中異黃酮積累的最佳輻射劑量為86.4 kJ/m2，此條件下總異黃酮得率為533.54±13.61μg

11、/gDW，是未處理空白對照組中總異黃酮得率(232.93±3.08μg/g DW)的2.29倍。
　　(2)利用qRT-PCR分析了黃芪皂苷和異黃酮生物合成路徑中19個酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，并結(jié)合LC-MS/MS分析皂苷和異黃酮類活性成分含量的變化規(guī)律，初步闡明了UV-B誘導(dǎo)調(diào)控黃芪皂苷和異黃酮生物合成路徑中的關(guān)鍵酶基因。實驗結(jié)果表明HMGR是UV-B誘導(dǎo)調(diào)控黃芪皂苷生物合成路徑中唯一的關(guān)鍵酶基因;PAL和C4是UV-B誘導(dǎo)調(diào)控黃

12、芪異黃酮生物合成路徑中的兩個關(guān)鍵酶基因。此外，UV-B誘導(dǎo)后黃芪毛狀根培養(yǎng)體系中抗氧化酶的活力以及提取物的抗氧化活性顯著增強(qiáng)，確定了黃芪毛狀根對UV-B誘導(dǎo)表現(xiàn)出了顯著的氧化應(yīng)激防御響應(yīng)。
　　4、真菌生物轉(zhuǎn)化和生物誘導(dǎo)雙重作用促進(jìn)黃芪毛狀根培養(yǎng)體系中黃芪甲苷的富集
　　(1)基于課題組首次分離出來的一株可產(chǎn)脫乙酰化酶的灰變青霉屬真菌Penicilliumcanescens，本研究構(gòu)建了海藻酸鈣固定化的P.canescens

13、孢子小球(IPC)和黃芪毛狀根共培養(yǎng)體系，一方面利用IPC所具有的脫乙酰化作用將一些低活性的黃芪甲苷前體衍生物（黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和異黃芪皂苷Ⅱ）轉(zhuǎn)化為高活性的黃芪甲苷，另一方面利用其生物誘導(dǎo)效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)黃芪毛狀根中黃芪甲苷和異黃酮類活性成分的合成與積累。
　　(2) IPC在黃芪毛狀根培養(yǎng)體系Ⅵ中脫乙酰生物轉(zhuǎn)化的最佳條件為:固定化孢子量為105個/瓶、共培養(yǎng)溫度30℃、pH7.0和共培養(yǎng)時間60 h。在此條件下，黃芪皂苷Ⅰ

14、、黃芪皂苷Ⅱ和異黃芪皂苷Ⅱ幾乎能夠完全轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷。同時，IPC還能夠顯著誘導(dǎo)大部分皂苷生物合成酶基因(AACT、HMGS、HMGR、MK、FPS、SS、SE和CAS)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上調(diào)。在IPC脫乙?；镛D(zhuǎn)化及其生物誘導(dǎo)雙重作用之下，黃芪甲苷得率(2.816±0.052 mg/g DW)相對于未處理空白對照組(0.193±0.007 mg/g DW)增加了14.59倍。此外，IPC處理的黃芪毛狀根中總異黃酮得率為673.21±10.

15、75μg/g DW，是未處理空白對照組中總異黃酮得率(236.97±3.50μg/g DW)的2.84倍。IPC同樣能夠顯著誘導(dǎo)異黃酮生物合成酶基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHR、CHI、IFS和I3'H)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上調(diào)。IPC還具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，能夠在60天貯存周期內(nèi)保持其脫乙酰化活性和生物誘導(dǎo)效果穩(wěn)定。此外，IPC在重復(fù)使用6次之后仍能保持良好的脫乙?；钚院蜕镎T導(dǎo)效果，為后續(xù)利用該技術(shù)手段工業(yè)化生產(chǎn)黃芪甲苷奠定了堅實