農(nóng)桿菌誘導(dǎo)北柴胡毛狀根體系建立及UGT基因功能初步研究.pdf

1、北柴胡（Bupleurum chinense DC.）是中藥柴胡的重要基源植物，柴胡皂苷是其主要藥效成分。糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyltransferase; UGT)是柴胡皂苷生物合成途徑的后修飾酶，其中后修飾作用是形成柴胡皂苷種類多樣性的主要因素。本研究對(duì)可能參與皂苷生物合成的BcUGT10基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。一方面，以發(fā)根農(nóng)桿菌為誘導(dǎo)菌株，建立北柴胡毛狀根誘導(dǎo)體系，進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的北柴胡BcUGT10基因的遺傳轉(zhuǎn)化初步研

2、究。另一方面，構(gòu)建BcUGT10基因原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)其表達(dá)，利用重組酶蛋白進(jìn)行體外酶活分析，探究BcUGT10基因的功能，為最終闡明柴胡皂苷生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　1設(shè)計(jì)多種誘導(dǎo)條件，包括不同菌種種類、外植體類型、侵染方式和侵染時(shí)間等，探索建立穩(wěn)定的北柴胡毛狀根誘導(dǎo)體系。結(jié)果在采用發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染北柴胡無菌苗葉基部，菌液浸染20 min，置于固體培養(yǎng)基（B5+乙酰丁香酮200μmol/L+蔗糖20g/L或

3、MS+NAA6 mg/L+乙酰丁香酮200μmol/L+蔗糖20 g/L）共培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)，10d左右發(fā)出毛狀根。由此建立了北柴胡毛狀根誘導(dǎo)體系。
　　2設(shè)置多種處理，包括3種培養(yǎng)基:B5、改良White和WPM，3種外源激素種類:IBA、IAA和NAA，真菌誘導(dǎo)子為黑曲霉誘導(dǎo)子，每組處理設(shè)計(jì)2～4個(gè)濃度梯度，培養(yǎng)三個(gè)月收獲稱重，測定其產(chǎn)量變化，HPLC方法檢測毛狀根柴胡皂苷含量。結(jié)果在添加0.5 mg/L IBA的B5

4、培養(yǎng)基中，毛狀根產(chǎn)量（干重）和柴胡皂苷產(chǎn)量最高，分別為2.4 g和9.05 mg。篩選出北柴胡毛狀根最適離體培養(yǎng)條件。
　　3以北柴胡毛狀根誘導(dǎo)體系為基礎(chǔ)，進(jìn)行發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BcUGT10基因轉(zhuǎn)化北柴胡初步研究。誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根經(jīng)25 mg/L潮霉素篩選獲得3條抗性毛狀根，PCR檢測后，未得到陽性轉(zhuǎn)化毛狀根。后續(xù)將重新侵染一批外植體，期望獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根。
　　4通過擬南芥浸花法，進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的BcUGT10基因轉(zhuǎn)化