抗寒基因的克隆及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ICE1基因轉(zhuǎn)化柑橘的研究.pdf

1、事中巖青史學(xué)Y8lJ6830HUAZHoNGAGRICUL，rURALUNIVERSITY博士學(xué)位論文PhDDISSERTATION抗寒基因的克隆及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ICEl基因轉(zhuǎn)化柑橘的研究ColdToleranceGeneCloningandAgrobacterium—mediatedICElGeneTransferinCitrus研究生：CANDH)』虬喳：導(dǎo)師：SUPERⅥSOR：專業(yè)：MAJOR：研究方向：RESEARCHARE

2、A：黃家權(quán)H【『ANGJMQUAN孫中海教授PROFSUNZHONGHAI果樹學(xué)POMOLOGY果樹生物技術(shù)B10TECHNOLOGYOFFRIⅡTTREE中國武漢WUttAN，CHINA二00五年一月January，2005華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文中文摘要柑橘是世界上最重要的果樹之一，在我國水果產(chǎn)業(yè)中占據(jù)了重要的經(jīng)濟(jì)地位。然而，周期性的凍害嚴(yán)重影響了柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)，這個(gè)問題的解決有賴于柑橘的抗寒育種和抗寒栽培。柑橘類植物的多胚性、遺傳背

3、景復(fù)雜、童期長(zhǎng)、單性結(jié)實(shí)的特點(diǎn)限制了柑橘常規(guī)育種的發(fā)展。柑橘組織培養(yǎng)以及建立在此基礎(chǔ)上的遺傳轉(zhuǎn)化為縮短育種周期、獲得抗寒、優(yōu)質(zhì)柑橘種質(zhì)資源提供了新的途徑。本實(shí)驗(yàn)以冷敏感的尤力克檸檬(Citruslimon(L)Burm￡CVEureka)上胚軸為材料，建立了高效的再生體系；以田間莖段為材料，建立了我國大力推廣的栽培品種一紐荷爾臍橙(Csinensis(L)OsbeekcvNewhall)的成年態(tài)組織培養(yǎng)體系，為成年態(tài)柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化打下了

4、基礎(chǔ)。利用從擬南芥中克隆的lCE』基因構(gòu)建了植物表達(dá)載體，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因?qū)肓擞攘藱幟手?，初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的檸檬實(shí)生苗轉(zhuǎn)化體系。主要研究結(jié)果如下：1)研究了影響檸檬(Climon(L)Burm，fCVEureka)不定芽再生的主要因素。結(jié)果表明：外植體類型，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比，暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)檸檬不定芽的再生有顯著的影響。上胚軸是再生不定芽的最佳外植體類型。上胚軸在基本培養(yǎng)基中能形成不定芽，BAP和NA

5、A的加入則有利于不定芽的再生。當(dāng)BAP和NAA濃度分別為1O和O1mgLd時(shí)，上胚軸不定芽分化率達(dá)到766％，此時(shí)不定芽數(shù)也達(dá)到最高，為925個(gè)。暗培養(yǎng)20d有利于不定芽數(shù)的提高，最高達(dá)到每個(gè)上胚軸1346個(gè)。不定梢在附加IBA或NAA的MT培養(yǎng)基中均可生成不定根。IBA有利于不定根的伸長(zhǎng)，NAA有利于不定根數(shù)量的增加。2)利用紐荷爾臍橙(Csinensis(L)OsbeckCVNewhall)田間成年態(tài)莖段為材料，建立了高效的植株再生

6、體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：紐荷爾臍橙節(jié)段以及節(jié)間莖段均可通過器官發(fā)生途徑再生不定芽。光照條件和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合影響了不定芽的再生，在10mgL。BAP和05mgLlNAA的培養(yǎng)基中，15d暗培養(yǎng)有利于不定芽的再生，此時(shí)節(jié)間莖段不定芽的再生率達(dá)到了852％，平均每個(gè)外植體上產(chǎn)生了37個(gè)不定芽。伸長(zhǎng)的不定芽在附加05或10mgL。1NAA的1／2MT生根培養(yǎng)基中生根并移栽成活。3)根據(jù)GeneBank中已驗(yàn)證功能的甘油酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)