根癌農桿菌介導WIN1基因轉化煙草及其轉基因外植體培育.pdf

1、近年來,植物基因工程技術飛速發(fā)展,轉基因植物在很多領域的研究推廣取得了令人矚目的成績。植物基因工程中常用的轉化方法一般是通過土壤農桿菌系統(tǒng)、植物病毒系統(tǒng)和DNA直接導入法這三種方法進行。土壤農桿菌轉化系統(tǒng)包括Ti質粒轉化系統(tǒng)和Ri質粒轉化系統(tǒng)。Ti質粒轉化系統(tǒng)又包括共和載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。根癌農桿菌轉化方式有多種,如活體接種法、共培養(yǎng)轉化法、葉盤轉化法等。植物病毒載體系統(tǒng)一般包括單鏈RNA植物病毒載體系統(tǒng)、單鏈DNA植物病毒載體系統(tǒng)

2、和雙鏈DNA植物病毒載體系統(tǒng)。DNA直接導入法通常分為化學物質誘導法、電穿孔法、脂質法、微注射法、基因槍法和花粉管通道法等。轉基因技術快速發(fā)展的同時轉基因植物檢測技術也在不斷地進步和完善,目前被廣泛應用的轉基因植物檢測方法有三類:整合水平上的檢測、轉錄水平上的檢測和表達水平上的檢測。整合水平上的檢測通常有PCR檢測、Southern blot檢測和染色體原位雜交檢測等;轉錄水平上的檢測通常包括RT-PCR檢測、Northern blot

3、雜交檢測等;還有表達水平上的檢測通常包括組織化學染色檢測、Western blot檢測、熒光蛋白檢測、ELISA檢測、葉片涂抹除草劑檢測和葉片退綠檢測等。
　　 2004年Broun等第一次克隆出WIN1基因與蠟質代謝過程中蠟質基因表達密切相關,本實驗通過轉基因技術將WIN1基因導入煙草K326,改變其角質膜厚度和成分,以此來提高煙草K326抗旱、抗病和抗寒等性能。該項研究結果不僅對認識和揭示植物角質膜的結構功能有重要的理論意義

4、,而且對植物基因工程技術改良和培育抗逆性強的優(yōu)良植物品種以及農業(yè)生產都具有重要的應用價值。
　　 本實驗從野生型擬南芥花蕾中提取總RNA擴增成WIN1基因,以載體PBI121為中間載體構建出植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1,最后將本實驗室構建成功的植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1作為轉基因載體,運用根癌農桿菌轉化法中的葉盤法將目的基因WIN1轉入煙草k326中,在轉化的不同階段篩選出四種最佳培養(yǎng)基對轉化后

5、外植體進行培養(yǎng):(1)煙草葉盤共培養(yǎng)培養(yǎng)基T1:MS+1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA;(2)煙草濾菌培養(yǎng)基T2:MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+500mg/L Carb;(3)煙草篩選培養(yǎng)基T3:MS+100mg/L Kan;(4)煙草繼代培養(yǎng)基T4:MS+80mg/L Kan+300mg/L Carb。
　　 本實驗通過根癌農桿菌介導法將WIN1基因導入煙草K326中,改變了煙草k326染色體基因組