根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗寒基因轉(zhuǎn)錄因子CBF轉(zhuǎn)化蘋果的研究.pdf

1、本研究以蘋果(MalusdomesticaBorkh)營(yíng)養(yǎng)系砧木M26和栽培品種嘎拉試管苗為試驗(yàn)材料，以農(nóng)桿菌EHA105為媒介把目的基因——抗寒基因的轉(zhuǎn)錄因子CBF導(dǎo)入蘋果。通過(guò)對(duì)影響葉片、白化莖段離體再生不定芽和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium)EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率的若干因素的研究，優(yōu)化了蘋果再生不定芽系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并成功將CBF基因?qū)氲搅颂O果的基因組中。 主要研究結(jié)果如下： 1.蘋果不同外植

2、體再生不定芽能力不同，以白化莖段的再生效果優(yōu)于葉片。適宜蘋果白化莖段不定芽再生的體系為：繼代苗暗培養(yǎng)20天左右獲得白化莖段，取1～2節(jié)位的白化莖段切成0.5cm的小段，接種(平放)在MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2～3周就會(huì)有芽點(diǎn)出現(xiàn)。M26和Gala的不定芽再生效率均達(dá)到95﹪以上。 2.培養(yǎng)基中添加適宜濃度的BA(5.0mg/L)和TDZ(1.0mg/L)可使M26白化莖段不定芽再生達(dá)到較高的水平，但TDZ的使用會(huì)增加再生芽的玻璃化現(xiàn)

3、象，以5.0mg/L的BA用于M26白化莖段不定芽再生較為適宜。 3.白化莖段的褐化現(xiàn)象比葉片嚴(yán)重，在再生培養(yǎng)基中添加100mg/LVc可以抑制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，1mg/L的AgNO3提高蘋果不定芽的再生效率；當(dāng)Vc濃度超過(guò)400mg/L或AgNO3濃度超過(guò)3mg/L時(shí)，將抑制蘋果白化莖段不定芽的再生，且白化莖段傷口處褐化現(xiàn)象加重。 4.繼代苗苗齡對(duì)白化莖段不定芽的再生有很大影響：取自繼代培養(yǎng)20～25天的白化莖段上取材的

4、1～2節(jié)位的莖段，再生頻率最高。低于此苗齡白化莖因抽生太短不利于取材，而高于此苗齡，莖段分化率明顯降低，并且褐化現(xiàn)象加重。 5.在根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，當(dāng)以白化莖段和葉片為轉(zhuǎn)化材料時(shí)，有效的Km選擇壓分別為12mg/L和10mg/L；適宜的頭孢霉素濃度為200mg/L。 6.乙酰丁香酮(AS)可以誘導(dǎo)vir區(qū)基因的表達(dá)，促進(jìn)T-DNA的轉(zhuǎn)移，在侵染液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加30μmol/L的AS可以提高蘋果

5、的基因轉(zhuǎn)化效率。 7.通過(guò)對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的各種因素進(jìn)行篩選，得到了一條最佳的轉(zhuǎn)化途徑：外植體在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1天；農(nóng)桿菌活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌液濃度為OD600=0.6左右；侵染外植體10min；共培養(yǎng)2天；然后脫菌、選擇同時(shí)進(jìn)行。 8.共有12個(gè)轉(zhuǎn)化株系通過(guò)了卡那霉素抗性檢測(cè)，具體包括三個(gè)方面：①轉(zhuǎn)化株在附加卡那霉素50mg/L的繼代培養(yǎng)基上能夠連續(xù)增殖繼代，②轉(zhuǎn)化株葉片在附加卡那霉素30mg/L的分化培養(yǎng)基上