舒肝顆粒對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的凋亡作用.pdf

1、目的： 肝纖維化(HF)是各種原因引起的慢性肝損傷所共有的病理改變，肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化增殖是HF形成的中心環(huán)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過量產(chǎn)生和沉積是形成HF，最終導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因。因此，抑制HSC活化增殖、促進(jìn)HSC凋亡、抑制膠原合成分泌、促進(jìn)膠原降解可抗肝纖維化。目前，抗肝纖維化尚無有效的治療藥物，西醫(yī)抗肝纖維化治療主要有抗氧化劑、細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑、血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)劑、抑制信號(hào)通路等藥物，這些藥物或因毒性

2、太大，或抗肝纖維化的作用不強(qiáng)，使臨床應(yīng)用受到限制。近年來，中醫(yī)中藥治療肝纖維化顯示出特有的優(yōu)越性，包括單方和復(fù)方的應(yīng)用和研究，有的研究已深入到分子水平。剔毒護(hù)肝方、復(fù)方861均從分子水平研究表明具有抑制體外培養(yǎng)的HSC增殖和促進(jìn)HSC凋亡的作用。舒肝顆粒主要是針對(duì)酒精性肝病(ALD)尤其是酒精性肝纖維化的防治。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證明舒肝顆粒能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，抑制膠原蛋白的分泌，可減少膠原纖維在肝臟內(nèi)的沉積。為了進(jìn)一步探討舒肝顆粒對(duì)肝纖

3、維化的逆轉(zhuǎn)是否有作用，我們采用舒肝顆粒作用于體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞，觀察其是否對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡有影響，以探討舒肝顆粒對(duì)肝纖維化的防治作用的機(jī)制，為舒肝顆粒的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論依據(jù)。 方法： １．體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)。以5×104接種培養(yǎng)好的肝星狀細(xì)胞在六孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入舒肝顆粒，分為三個(gè)濃度組：4.2mg/ml, 2.8mg/ml, 1.4mg/ml。加藥作用24小時(shí)后，取出鏡下觀察

4、細(xì)胞形態(tài)的變化。然后吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液，1500轉(zhuǎn)/分離心，冷PBS沖洗后再離心，丟棄上清液，每根試管中加入100μl冷PBS,振蕩搖勻，成單細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞濃度1×106，緩沖液稀釋1:4；取100μl懸液，于5ml流式管中加入5μl AnnexinV/FITC和10μl 20mg/ml的碘化丙錠，混勻后室溫避光孵育15min；在反應(yīng)管中加入400μl PB，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。 2．以5×104接種

5、肝星狀細(xì)胞在六孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后加藥，濃度組同前，加藥培養(yǎng)24小時(shí)后，鏡下觀察。吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞液，1500轉(zhuǎn)/分離心，冷PBS沖洗后再離心，丟棄上清液，每根試管中加入100μl冷PBS，振蕩搖勻，成單細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞濃度1×106，緩沖液稀釋1:4；取100μl懸液，于5ml流式管中加入5μl CD95抗體，混勻后室溫避光孵育15min；在反應(yīng)管中加入400μl PBS，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。通過流式細(xì)胞儀檢測

6、CD95，探討舒肝顆粒誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡的可能途徑。 3．細(xì)胞培養(yǎng)后爬片，以同樣的藥物濃度作用24小時(shí)后，用4℃預(yù)冷1:1丙酮和乙醇固定；蒸餾水沖洗、PBS浸泡、雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；采用SABC法，先滴加試劑A孵育15分鐘，再滴加一抗Bax，37C°孵育3小時(shí)，PBS沖洗；依次滴加試劑B、試劑C，每次孵育10分鐘，PBS沖洗三次；再滴加DAB顯色劑，沖洗、晾干、封片；采用Image plus 7.0 系統(tǒng)顯微鏡照相

7、。 4.重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過程檢測Bcl-2。 結(jié)果： 1. 正常對(duì)照組的凋亡率是3.4±0.82,不同濃度的舒肝顆粒1.4mg/ml，2.8mg/ml，4.2mg/ml，對(duì)肝星狀細(xì)胞的凋亡率分別是：42.61±6.42,61.07±3.19,87.84±5.49,各組的凋亡率較正常對(duì)照組明顯增高，差別具有顯著性(P<0.05)。在1.4mg/ml組，肝星狀細(xì)胞的早期凋亡率明顯較正常對(duì)照組增加(P<0.05)，而中晚期

8、凋亡率較少。在2.8mg/ml組，肝星狀細(xì)胞的早期凋亡率和中晚期凋亡率均明顯升高。4.2mg/ml組，肝星狀細(xì)胞在舒肝顆粒作用24小時(shí)后，大部分已屬于中晚期凋亡，早期凋亡較低濃度組明顯減少，但較正常對(duì)照組仍明顯增高(P<0.05),從早期凋亡和中晚期凋亡的總體趨勢看，隨著濃度增高，總的凋亡率增加。 2.正常對(duì)照組的CD95的表達(dá)率是0.10±0.03,不同濃度的舒肝顆粒1.4mg/ml，2.8mg/ml，4.2mg/ml，對(duì)肝星

9、狀細(xì)胞的CD95的表達(dá)率分別是：4.77±0.84, 9.44±0.61, 24.51±5.91(P<0.05), 并隨著濃度增高，CD95的表達(dá)率也增高。 3. Bax的表達(dá)正常組最少，隨著藥物濃度組的增高，Bax的表達(dá)增高，且差別有顯著性(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)，藥物濃度組與正常對(duì)照組無明顯差別(P>0.05)。Bax/bcl-2的比值隨著藥物濃度組的增加而比值升高。 結(jié)論： 1. 舒肝顆?？烧T導(dǎo)肝