內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化(liver fibrosis)是多種慢性肝病發(fā)展的共同病理基礎(chǔ),其發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)是靜止的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)活化增殖,導(dǎo)致以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積。因此,促進(jìn)活化的HSC凋亡是防治肝纖維化的重要手段。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后折疊、聚集的場(chǎng)所,同時(shí)也是調(diào)節(jié)

2、細(xì)胞內(nèi)鈣水平的場(chǎng)所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是近年來(lái)新被認(rèn)識(shí)的一種凋亡途徑,與經(jīng)典線粒體、死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不同。ERS通過減少未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的沉積,ERS激活促凋亡信號(hào)通路與多種疾病密切相關(guān),但ERS在誘導(dǎo)活化肝星狀細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)選用大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6為研究對(duì)象,并以PDGF誘導(dǎo)其活化,探討ERS對(duì)HSC凋亡

3、的調(diào)控及相關(guān)機(jī)制,主要研究?jī)?nèi)容概括如下:
　　1.ERS促進(jìn)活化的HSC凋亡
　　為了觀察ERS對(duì)活化的HSC凋亡的影響,給予PDGF體外誘導(dǎo)HSC-T6活化作為對(duì)照組,再分別給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(Thapsigargin,TG)處理,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ERS對(duì)活化的HSC凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TG組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組,提示ERS可能參與活化HSC的凋亡。
　　2.ERS對(duì)活化HSC分泌α-SMA和

4、Col1α1的影響
　　為了觀察ERS對(duì)活化的HSC分泌α-SMA和Col1α1的影響,給予PDGF體外誘導(dǎo)HSC活化作為對(duì)照組,再分別給予TG處理,采用Western blot法檢測(cè)肝纖維化標(biāo)志性蛋白α-SMA、Col1α1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PDGF體外誘導(dǎo)HSC活化,α-SMA與Col1α1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào);與對(duì)照組相比,TG組α-SMA、Col1α1的表達(dá)顯著下調(diào)。提示ERS可能抑制活化HSC分泌α-SMA和Col1α1的

5、表達(dá)。
　　3.ERS誘導(dǎo)活化HSC凋亡的調(diào)控及部分機(jī)制的研究
　　為了觀察Ca2+對(duì)ERS誘導(dǎo)活化的HSC凋亡的影響,以TG誘導(dǎo)活化的HSC作為模型組,再分別給予鈣離子螯合劑EGTA和BAPTA/AM處理,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,采用Western blot法檢測(cè)Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,TG明顯促進(jìn)HSC凋亡,同時(shí)

6、發(fā)現(xiàn)TG能顯著促進(jìn)HSC中Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達(dá)及活化,而給予EGTA和BAPTA/AM干預(yù)后,HSC的凋亡明顯受到抑制,Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白表達(dá)及活性均受到抑制。提示ERS誘導(dǎo)的活化HSC凋亡機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)Calpain、Capase-12、Capase-9、C

7、apase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　為了進(jìn)一步探討ERS誘導(dǎo)活化HSC凋亡的機(jī)制,分別給予Calpain抑制劑Calpeptin、Pan-Capase抑制劑z-VAD-FKM、JNK抑制劑SP600125及p38 MAPK抑制劑SB202190處理,采用流式細(xì)胞術(shù)觀察HSC凋亡率,Western blot法檢測(cè)Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK

8、蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組比較,C-Capase-12、Capase-9和C-Capase-3的蛋白表達(dá)明顯下降,而Pan-Capase抑制劑z-VAD-FKM組Calpain的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。提示ERS誘導(dǎo)的活化HSC凋亡機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　4.腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related

9、apoptosis inducing-ligand,TRAIL)通過ERS對(duì)活化的HSC凋亡的調(diào)控及部分機(jī)制的研究
　　前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期,枯否細(xì)胞可以通過分泌TRAIL誘導(dǎo)活化HSC凋亡。為了進(jìn)一步探討TRAIL與ERS誘導(dǎo)的活化HSC凋亡的相互關(guān)聯(lián)。體外給予PDGF刺激活化的HSC,再分別給予TRAIL與ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(Tunicamycin,TN)處理,觀察各組凋亡基因Bax mRNA、Caspase

10、-3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Caspase-12,CHOP,GRP78的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與PDGF刺激活化的HSC的對(duì)照組相比較,TRAIL組與TN組Bax mRNA表達(dá)明顯上調(diào)、Caspase-3的活化增加,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Caspase-12,CHOP,GRP78的表達(dá)均明顯上調(diào)。提示ERS可能參與TRAIL調(diào)控活化的HSC凋亡。
　　以上結(jié)果提示,ERS參與活化HSC凋亡的調(diào)控,其機(jī)制可能與其釋放細(xì)胞內(nèi)鈣離子,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子