大鼠皮層神經元內質網應激相關凋亡的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠皮層神經元氧糖剝奪損傷后內質網應激相關凋亡的研究
　　目的：觀察大鼠皮層神經元體外模擬缺血再灌注后神經元凋亡情況及內質網應激相關變化。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠大腦皮層神經元,神經元特異性烯醇化酶免疫熒光染色法鑒定培養(yǎng)的神經元純度,隨機分為正常對照組及缺血再灌注模型組,采用氧糖剝奪法建立模擬缺血再灌注神經元模型。觀察體外培養(yǎng)的神經元形態(tài),采用流式細胞儀AnnexinV-FITC、PI染色法檢測細胞凋亡率,Hoechst

2、33258染色后通過熒光顯微鏡觀察神經元細胞核形態(tài)變化,Western-blot檢測神經元GRP78、activecaspase12蛋白水平。結果：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經元成功,神經元純度在90％以上。模型組神經元在再灌注6h后凋亡增加不顯著,但在12h、24h、48h均較正常對照組明顯增加,并隨著再灌注后時間的延長而逐漸上升。Hoechst33258染色可見凋亡細胞核致密濃染,熒光增強。模型組GRP78蛋白表達逐漸增多,在再灌注

3、后24h最多,但在48h時GRP78蛋白表達反而有下降,差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著再灌注時間的延長,activecaspase12蛋白表達量逐漸增多,在48h時表達最多,差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：體外原代培養(yǎng)神經元采用氧糖剝奪損傷法,成功構建了模擬缺血再灌注模型,該模型可見神經元凋亡,內質網應激途徑介導了神經元凋亡的發(fā)生。
　　第二部分低分子肝素對大鼠皮層神經元內質網應激相關凋亡的影響
　　目的

4、：觀察低分子肝素對大鼠皮層神經元氧糖剝奪損傷后細胞凋亡的影響。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠大腦皮層神經元,觀察體外培養(yǎng)神經元形態(tài),神經元特異性烯醇化酶免疫熒光染色法鑒定培養(yǎng)的神經元純度。氧糖剝奪法建立模擬缺血再灌注神經元模型。隨機分為正常對照組、缺血再灌注模型組(缺血6h/再灌注24h)及低分子肝素干預組(缺血建模前2h給藥,分為0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、、5.0μg/ml組)。MTT法檢測各組神經元光密度(O

5、D)值、計算細胞活力、篩選最佳藥物濃度。AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率,Hoechst33258染色觀察各組神經元細胞核形態(tài)變化。結果：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經元成功,神經元純度在90%以上。模擬缺血再灌注后神經元活力明顯下降,細胞凋亡率顯著增加,與正常對照組比較差異明顯,具有統計學意義(P<0.01)。0.1μg/ml濃度低分子肝素組神經元活力與對照組比較無顯著差異,而濃度為0.5μg/ml、2

6、.5μg/ml、5.0μg/ml的低分子肝素組神經元活力均比缺血再灌注組顯著增加,具有統計學意義(P<0.01)。Hoechst33258染色可見正常對照組細胞核呈彌散均勻藍光,缺血再灌注組凋亡細胞核致密濃染,熒光增強,低分子肝素組凋亡細胞數量較缺血再灌注組明顯減少。結論：低分子肝素能提高體外培養(yǎng)神經元氧糖剝奪損傷后的細胞活力,可降低神經元凋亡,具有明顯的神經保護作用。
　　第三部分低分子肝素對大鼠皮層神經元內質網應激神經保護作用

7、機制的研究
　　目的：研究低分子肝素對大鼠皮層神經元氧糖剝奪損傷后神經保護作用的機制。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠大腦皮層神經元,觀察體外培養(yǎng)神經元形態(tài),神經元特異性烯醇化酶免疫熒光染色法鑒定培養(yǎng)的神經元純度。氧糖剝奪法建立模擬缺血再灌注神經元模型。隨機分為正常對照組、缺血再灌注模型組(缺血6h/再灌注24h)及低分子肝素干預組(缺血建模前2h給藥,0.5μg/ml)。Western-blot檢測神經元bcl-2、bax、GRP78

8、和activecaspase12的蛋白水平。采用負載Fura-2/AM,雙波長熒光分光光度計法測定神經細胞胞漿鈣離子濃度[Ca2+]i。結果：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經元成功,其純度在90%以上。Western-blot結果顯示:與對照組相比,模型組的bcl-2蛋白表達水平明顯降低,bax表達水平明顯升高,bcl-2/bax比值明顯下降,結果具有顯著性差異(P<0.01);與模型組相比,低分子肝素組bcl-2蛋白表達水平有明顯升高,b

9、ax蛋白表達有明顯下降,bcl-2/bax比值明顯升高,結果具有顯著性差異(P<0.01)。與對照組相比,模型組GRP78蛋白表達水平明顯升高,低分子肝素組GRP78蛋白表達水平最高,結果均具有明顯差異(P<0.05);與對照組相比,模型組activecasase12蛋白表達水平明顯升高,低分子肝素組activecasase12蛋白表達水平明顯降低,結果均具有明顯差異(P<0.05)。鈣離子濃度測定顯示:模型組[Ca2+]i與對照組相比