IRE1α通路及PDIA6對(duì)PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控的分子機(jī)制.pdf

1、目的：
　　需肌醇蛋白1(inositol requiring1，IRE1)是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Ⅰ型跨膜蛋白，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器中最保守的一個(gè)，具有激酶和核糖核酸內(nèi)切酶的雙重活性。在哺乳動(dòng)物中，IRE1有兩種剪切體-IRE1α和IRE1β，其中IREα廣泛分布于各種細(xì)胞中，而IRE1β僅在胃腸中表達(dá)，兩者在功能上沒有區(qū)別。生理?xiàng)l件下，IRE1會(huì)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶BiP/GRP78結(jié)合，保持未活化狀態(tài)。
　　PDIA6(Pr

2、otein disulfide isomerase family A，member6)又被稱為P5，屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase，PDI)家族成員，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體上。有研究認(rèn)為，PDIA6既是一種折疊酶，同時(shí)也有分子伴侶的活性。作為折疊酶，PDIA6可催化蛋白二硫鍵的形成;作為分子伴侶，PDIA6可與底物結(jié)合，幫助酶的底物去折疊或折疊，提高酶的效率。已有研究表明，在生理容許范

3、圍內(nèi)，通過與IRE1腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域的特殊胱氨酸相結(jié)合，PDIA6對(duì)于限制UPR信號(hào)很重要，特別是在激活狀態(tài)。PDIA6可終止IRE1信號(hào)。
　　越來越多的證據(jù)顯示，許多病理?xiàng)l件會(huì)持續(xù)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)引發(fā)UPR，從而引起疾病的發(fā)生，如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（Posttraumatic stress disorder，PTSD）。PTSD又稱延遲性心因性反應(yīng)，是由突發(fā)性、災(zāi)難性事件（如地震、海嘯、洪災(zāi)等）導(dǎo)致個(gè)體延后出現(xiàn)和長期持續(xù)存在的一種精神障礙

4、。PTSD是以創(chuàng)傷性事件為主要致病因素，其典型臨床表現(xiàn)主要包括:反復(fù)發(fā)生的闖入性創(chuàng)傷事件再體驗(yàn)及記憶異常，持續(xù)逃避回憶及反應(yīng)麻木，警覺性增高和負(fù)性認(rèn)知的改變等。PTSD在總?cè)丝诘慕K生患病率達(dá)到約7％，對(duì)人們的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，目前對(duì)其研究已涉及多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，如內(nèi)分泌學(xué)、行為學(xué)、心理學(xué)及神經(jīng)生物學(xué)等。雖然人們對(duì)PTSD的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，但藍(lán)斑長期以來被認(rèn)為與PTSD發(fā)病有關(guān)。
　　本課題組前期研究已證實(shí)，PTSD大鼠藍(lán)斑神

5、經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的變化，與PTSD的發(fā)病機(jī)制有一定關(guān)聯(lián)。在此基礎(chǔ)上，本研究擬以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1α為切入點(diǎn)，并給予大鼠IRE1α特異性抑制劑STF-083010進(jìn)行干預(yù)，探討IRE1α通路及分子伴侶PDIA6調(diào)控PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機(jī)制，為深入研究PTSD發(fā)病及預(yù)防、治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、應(yīng)用單一連續(xù)應(yīng)激(Single Prolonged Stress，SPS)法構(gòu)建大鼠PTSD模型。

6、選取100只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組和SPS刺激后1d、4d、7d、14d組。
　　2、應(yīng)用高架十字迷宮(the elevated plus maze，EPM)行為學(xué)方法驗(yàn)證PTSD-SPS模型是否制作成功;采用透射電鏡技術(shù)及原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元凋亡變化;采用Western Blot檢測正常對(duì)照組和模型組大鼠藍(lán)斑CHOP蛋白表達(dá)。
　　3、采用免疫熒光、Wester

7、n Blot及qRT-PCR檢測正常對(duì)照組和模型組大鼠藍(lán)斑IRE1α蛋白及mRNA表達(dá);采用Western Blot及qRT-PCR檢測正常對(duì)照組和模型組大鼠藍(lán)斑XBP1 s和BiP/GRP78蛋白及mRNA表達(dá);采用免疫熒光和WesternBlot檢測正常對(duì)照組和模型組大鼠藍(lán)斑PDIA6蛋白表達(dá)。
　　4、另取96只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為2組:SPS刺激后1d組和7d組;然后每組再隨機(jī)分為4組:non-SPS+ vehi

8、cle組（即正常對(duì)照組），SPS+ vehicle組（SPS刺激后，腹腔注入與抑制劑等體積的DMSO），SPS+ STF組（SPS刺激后，腹腔注入IRE1α抑制劑STF-083010），non-SPS+ STF組(正常大鼠腹腔注入抑制劑STF-083010)。采用Western Blot檢測大鼠藍(lán)斑IRE1α、XBP1s、BiP/GRP78和CHOP蛋白表達(dá);應(yīng)用TUNEL染色技術(shù)檢測大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元的凋亡改變;應(yīng)用高架十字迷宮(EPM)

9、評(píng)估大鼠的行為學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　一、大鼠行為學(xué)變化
　　高架十字迷宮測試結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，SPS刺激后7d，大鼠的開臂滯留時(shí)間百分比（開臂滯留時(shí)間/總時(shí)間）和開臂進(jìn)入次數(shù)百分比（開臂進(jìn)入次數(shù)/總進(jìn)臂次數(shù)）均顯著降低。
　　二、大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元凋亡情況
　?。ㄒ唬┩干潆婄R觀察凋亡藍(lán)斑神經(jīng)元
　　正常對(duì)照組大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元核大而圓，染色質(zhì)分布均勻。SPS刺激后，可見藍(lán)斑中部分神經(jīng)元核內(nèi)染色質(zhì)

10、濃縮、凝結(jié)成塊，并沿核膜排列、邊集;胞質(zhì)溶解。
　?。ǘ㏕UNEL染色結(jié)果
　　正常對(duì)照組PTSD大鼠藍(lán)斑中TUNEL陽性神經(jīng)元少見;與正常對(duì)照組比，SPS刺激后大鼠藍(lán)斑TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，且細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間延長而增加，于SPS刺激后7d達(dá)高峰，14d顯著降低。
　?。ㄈ￤estern Blot檢測結(jié)果
　　SPS刺激后大鼠藍(lán)斑中CHOP蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加。CHOP表達(dá)于SPS刺激后1

11、d開始升高，7d達(dá)峰值，14d表達(dá)降低。
　　三、大鼠藍(lán)斑中IRE1α的表達(dá)變化
　　（一）免疫熒光結(jié)果
　　激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠IRE1α蛋白主要表達(dá)于藍(lán)斑神經(jīng)元胞質(zhì)中，在SPS刺激后1d，IRE1α表達(dá)增加最顯著。
　?。ǘ￤estern Blot檢測結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，IRE1α蛋白于SPS刺激后早期其表達(dá)即明顯增加，隨后逐漸下降。IRE1α蛋白表達(dá)于SPS刺激后1d

12、達(dá)高峰。
　?。ㄈ﹒RT-PCR檢測結(jié)果
　　與Western Blot檢測結(jié)果相一致，SPS刺激后IRE1α的mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高，于刺激后1d達(dá)高峰，隨后逐漸降低。
　　四、大鼠藍(lán)斑中XBP1s的表達(dá)變化
　　（一）Western Blot檢測結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，XBP1的活性形式XBP1s于SPS刺激后其表達(dá)明顯增加，7d達(dá)高峰，14d顯著降低。
　　（二）qRT-PC

13、R檢測結(jié)果
　　與Western Blot檢測結(jié)果相一致，SPS刺激后XBP1s的mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高，于刺激后7d達(dá)高峰，14d顯著下降。
　　五、大鼠藍(lán)斑中BiP/GRP78的表達(dá)變化
　　（一）Western Blot檢測結(jié)果
　　SPS刺激后大鼠藍(lán)斑中BiP/GRP78蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加。BiP/GRP78表達(dá)于SPS刺激后1d開始升高，14d達(dá)高峰。
　?。ǘ﹒RT-P

14、CR檢測結(jié)果
　　與Western Blot檢測結(jié)果相一致，SPS刺激后BiP/GRP78的mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高，于刺激后14d達(dá)高峰。
　　六、大鼠藍(lán)斑中PDIA6的表達(dá)變化
　?。ㄒ唬┟庖邿晒饨Y(jié)果
　　與正常對(duì)照組比較，SPS刺激后4d，大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元中PDIA6表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨后其表達(dá)逐漸降低。
　　（二）Western Blot檢測結(jié)果
　　SPS刺激后大鼠藍(lán)斑PDIA6蛋白表

15、達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，于刺激后4d達(dá)高峰，隨后逐漸下降，與其免疫熒光結(jié)果基本一致。
　　七、STF-083010對(duì)大鼠藍(lán)斑中IRE1α通路及細(xì)胞凋亡的影響
　　（一）大鼠行為學(xué)改變
　　SPS刺激后7d，SPS+STF組中大鼠的開臂滯留時(shí)間百分比和開臂進(jìn)入次數(shù)百分比均顯著高于SPS+ vehicle組。
　?。ǘ￤estern Blot檢測結(jié)果
　　SPS刺激后1d，SPS+STF組中大鼠藍(lán)斑IRE1α

16、蛋白表達(dá)較SPS+ vehicle組明顯降低; SPS刺激后7d，SPS+STF組中大鼠藍(lán)斑XBP1s、BiP/GRP78及CHOP蛋白表達(dá)較SPS+ vehicle組均顯著降低。
　?。ㄈ㏕UNEL染色結(jié)果
　　SPS刺激后7d，SPS+STF組中大鼠藍(lán)斑TUNEL陽性細(xì)胞凋亡率較SPS+ vehicle組顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1、PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元出現(xiàn)細(xì)胞凋亡變化，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。
　

17、　2、SPS刺激可誘導(dǎo)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的IRE1α通路的過度活化，這可能是導(dǎo)致PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制。
　　3、SPS誘導(dǎo)的IRE1α通路的活化可被特異性抑制劑STF-083010削弱，進(jìn)一步證實(shí)IRE1α通路的過度激活介導(dǎo)了PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元凋亡。也為PTSD的預(yù)防治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　4、SPS誘導(dǎo)藍(lán)斑神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，分子伴侶PDIA6的表達(dá)上調(diào)可能有利于藍(lán)斑神經(jīng)元存活，這為尋找治療PTSD的藥