足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)鈣神經(jīng)蛋白表達(dá)的調(diào)控研究.pdf

1、背景：
　　 在我國(guó),糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是終末期腎病(end stage renaldisease,ESRD)的第二大原因。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今未得到全面的認(rèn)識(shí),也沒(méi)有有效的治療方法。鈣神經(jīng)蛋白(calcineurin,CaN)是一種鈣離子敏感的蛋白磷酸激酶,能調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架蛋白synatopodin的穩(wěn)定性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積時(shí)引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。近來(lái)有研

2、究提示在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)時(shí)CaN活性增加。糖尿病(diabetes mellitus,DM)狀態(tài)下體內(nèi)棕櫚酸鹽升高,體外細(xì)胞試驗(yàn)證明棕櫚酸鹽能引起ERS。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的化學(xué)分子伴侶,體外大鼠肝細(xì)胞及糖尿病模型小鼠實(shí)驗(yàn)都證明UDCA能降低ERS感應(yīng)蛋白PKR類似的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase,P

3、ERK)和肌醇依賴酶1α(Inositol-rcquiring enzyme1α,IRE-α)的磷酸化,抑制ERS依賴的JNK凋亡途徑,緩解ERS引起的損傷。足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的主要成分,足細(xì)胞數(shù)量減少、足突消失是DN損傷時(shí)引起蛋白尿的重要原因。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)早期DN中存在足細(xì)胞ERS,但ERS對(duì)足細(xì)胞CaN的調(diào)控尚無(wú)報(bào)道。進(jìn)一步深入研究足細(xì)胞ERS對(duì)CaN的影響對(duì)糖尿病腎病甚至蛋白尿患者臨床上是否以及怎樣合理選擇使用鈣神經(jīng)

4、蛋白抑制劑(calcineurin inhibitor,CNI)具有指導(dǎo)意義,同時(shí),也有助于進(jìn)一步明晰CaN在蛋白尿發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 目的：
　　 以體內(nèi)、外試驗(yàn)方法,探討糖尿病腎病狀態(tài)下,足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)鈣神經(jīng)蛋白的變化。
　　 方法
　　 以C57BLKS/JLepr db/db早期糖尿病腎病模型小鼠為研究對(duì)象,以db/m小鼠為對(duì)照,分6周齡、9周齡和12周齡3組,使用激光共聚焦法檢測(cè)腎小球

5、足細(xì)胞CaN的變化特點(diǎn)。另以棕櫚酸鹽或聯(lián)用UDCA為刺激物,作用于永生小鼠足細(xì)胞系,觀察其對(duì)足細(xì)胞CaN表達(dá)的影響。使用Real-Time PCR的方法觀察不同棕櫚酸鹽濃度刺激下足細(xì)胞CaN mRNA水平的變化；使用激光共聚焦法和western blotting方法在蛋白水平檢測(cè)棕櫚酸鹽或聯(lián)用UDCA后足細(xì)胞CaN的變化；western blotting方法同時(shí)觀察足細(xì)胞骨架蛋白synpatopodin的變化。
　　 結(jié)果

6、>　　 (1)db/db糖尿病腎病模型小鼠腎小球足細(xì)胞CaN的表達(dá)隨尿蛋白量的增加而升高,分布與synatopodin相似,足細(xì)胞synaptopodin的表達(dá)隨蛋白量的增加而降低。
　　 (2)體外小鼠足細(xì)胞CaN的mRNA水平隨棕櫚酸鹽刺激濃度由250μM增加到500μM而明顯增加,高低濃度表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.05；激光共聚焦檢測(cè)棕櫚酸鹽作用下足細(xì)胞CaN的表達(dá)上調(diào),而加用UDCA后CaN的表達(dá)下降,p<0.