孕酮對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響及其機制研究.pdf

1、目的：阿爾茲海默病(Alzheimer?sdisease，AD)是一種以進行性認知功能障礙和記憶損傷為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)沉積被公認為AD的核心發(fā)病機制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為合成蛋白質(zhì)的細胞器,其功能改變對細胞產(chǎn)生深刻影響,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象功能障礙,導(dǎo)致過多的Aβ形成,從而引發(fā)一系列的病理改變。因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對阿爾茨海默病的發(fā)病起著重要影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后的未折疊蛋白反應(yīng)(unfol

2、dedproteinresponse,UPR)激活是對細胞的保護反應(yīng)；過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制的異常與AD神經(jīng)系統(tǒng)損害有關(guān)。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元以外的另一大類細胞且數(shù)量最多，在神經(jīng)退行性疾病中承擔(dān)重要角色,任何抑制星形膠質(zhì)細胞異常變化都有利于神經(jīng)退行性疾病的治療。孕酮(progseteron，PROG)作為神經(jīng)甾體具有神經(jīng)保護作用，但在阿爾茲海默病中孕酮對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用尚不明確，其中研究最多的是孕酮膜結(jié)合蛋白1（p

3、rogesteronereceptormembranecomponent1,PGRMC1），其可能在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究使用Aβ1-42誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKR-likeERkinase，PERK),磷酸化真核起始因子2的α亞單位(eukaryoticinitiationfactor2

4、kinase,eIF2α),并闡述神經(jīng)甾體孕酮以及PGRMC1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響及對PI3K/Akt/GSK3β信號通路的作用。
　　方法：
　　1、細胞培養(yǎng)
　　1.1大鼠大腦星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)
　　取新生24h內(nèi)的SD大鼠，消毒后，取大腦皮質(zhì)部分，用鑷子剝?nèi)ツX膜，剪碎，37℃水浴中胰酶消化15-20min，含10％FBS的高糖DMEM終止消化。使用巴氏吸管慢慢吹打細胞，制成單細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶

5、提前用多聚賴氨酸包被。細胞密度為1.0×106/L。37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，24h后首次半量更換培養(yǎng)液，以后每隔2-3d進行全量更換培養(yǎng)液。使用“二次震蕩法”純化星形膠質(zhì)細胞，使星形膠質(zhì)細胞純度超過95%，純化后重新接種于六孔板中，培養(yǎng)備用。
　　2、Aβ1-42寡聚
　　1mgAβ1-42溶于六氟異丙醇（Hexafluoroisopropanol,HFIP）中，使之溶解然后分裝，分裝后在通風(fēng)櫥中將HFIP揮發(fā)干

6、得Aβ肽膜，-20℃保存。用前用DMSO溶解肽膜，DMEM培養(yǎng)基稀釋至100μM，4℃放置24h，即得到Aβ寡聚體。
　　3、GFAP標(biāo)記免疫熒光染色觀察星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)
　　通過對GFAP（星形膠質(zhì)細胞特異性中間纖維蛋白）免疫熒光染色，觀察星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)。取出細胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，兔源GFAP（1:1000）4℃孵育過夜，二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。
　　4、實驗分組與給藥
　　4.1

7、Aβ1-42對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　星形膠質(zhì)細胞經(jīng)Aβ1-42處理不同時間，隨機分為Control、Aβ(2h)、Aβ(4h)、Aβ(8h)四組處理，行Westernblot檢測GRP78蛋白水平變化,其中Aβ1-42濃度為1μM。
　　4.2孕酮對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響
　　取星形膠質(zhì)細胞隨機分為Control、PROG(1μM)、Aβ1-42(1μM)、Aβ1-42+PROG處理組，行MTT細胞活性檢測

8、。
　　4.3孕酮對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　取星形膠質(zhì)細胞隨機分為Control、PROG、Aβ1-42、Aβ1-42+PROG，Westernblot檢測GRP78、p-PERK、p-eIf2α蛋白水平變化。
　　4.4孕酮對Aβ1-42所致星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制研究
　　4.4.1取星形膠質(zhì)細胞隨機分為Control、Aβ1-42、Aβ1-42+PROG、Aβ1-42+LiCl(GSK3β抑制

9、劑，10mM)，Westernblot檢測GRP78、p-GSK3β蛋白水平變化。
　　4.4.2取星形膠質(zhì)細胞隨機分為Control、Aβ1-42、Aβ1-42+PROG、Aβ1-42+PROG+LY294002(PI3K/Akt通路抑制劑，10μM)，Westernblot檢測GRP78、p-Akt、p-GSK3β蛋白水平變化。
　　4.4.3取星形膠質(zhì)細胞隨機分為Control、Aβ1-42、Aβ1-42+PROG、A

10、β1-42+PROG+AG205(PGRMC1抑制劑，10μM)，Westernblot檢測GRP78、p-PERK、p-eIf2α、p-Akt、p-GSK3β蛋白水平變化。
　　5、MTT法檢測細胞存活率
　　取出加藥處理后的細胞爬片，放入24孔板中，每孔加入40μLMTT（5mg?mL-1），于37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)基，每孔各加入300μLDMSO，混合均勻，酶標(biāo)儀測定各組細胞490nm波長處的吸光度（OD值），以各組

11、細胞吸光度與對照組吸光度的比值表示相對細胞存活率。
　　6、WesternBlot檢測GRP78、p-PERK、p-eIf2α、p-Akt、p-GSK3β表達
　　收集細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后煮沸變性，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗GRP78、p-PERK、p-eIf2α、p-Akt、p-GSK3β（1:1000）過夜，室溫孵育二抗，暗室中顯影。結(jié)果經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描，測定各條帶積分光密度，以目的蛋白

12、與β-actin積分光密度值的比值表示。
　　7、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
　　以上實驗均重復(fù)三次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析（onewayANOVA）繼以Dunnettttest對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、Aβ1-42誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　GFAP標(biāo)記的免疫熒光染色，觀察星形膠質(zhì)細

13、胞的形態(tài)。熒光顯微鏡下可見，星形膠質(zhì)細胞胞體飽滿，扁平，胞漿豐富。
　　WesternBlot結(jié)果顯示：與對照組相比，用1μMAβ1-42處理星形膠質(zhì)細胞4h，GRP78的表達顯著升高（P<0.05），說明1μMAβ1-42處理4h星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　2、孕酮對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響
　　MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，1μMAβ1-42作用于星形膠質(zhì)細胞4h后，細胞的存活率為對照組的(78.9±2.64)

14、%（P<0.05）。與單加Aβ1-42組比較，1μM孕酮與Aβ1-42共同處理4h，顯示出明顯的保護作用，細胞存活率為單加Aβ1-42組的(120.0±1.73)%（P<0.05）。
　　3、孕酮對Aβ1-42誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　WesternBlot結(jié)果顯示：與對照組相比，Aβ1-42誘導(dǎo)的模型組中GRP78、p-PERK和p-eIf2α表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，PROG保護組GRP

15、78、p-PERK和p-eIf2α表達水平顯著下降(P<0.05)；其中單加孕酮組GRP78、p-PERK和p-eIf2α表達水平與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　4、孕酮通過下調(diào)GSK3β減輕Aβ1-42誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　WesternBlot結(jié)果顯示：與對照組相比，Aβ1-42誘導(dǎo)的模型組中GRP78和p-GSK3β表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，PROG保護組GRP78和p-

16、GSK3β表達水平顯著下降(P<0.05)；LiCl（10mM）處理組GRP78和p-GSK3β表達水平顯著下降(P<0.05)。
　　5、孕酮通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　WesternBlot結(jié)果顯示：與對照組相比，Aβ1-42誘導(dǎo)的模型組中GRP78和p-GSK3β表達水平顯著升高(P<0.05)，p-Akt表達水平顯著降低。與模型組比較，PROG保護組GRP78和p-GSK3β表達水平顯

17、著下降(P<0.05)，p-Akt表達水平顯著升高(P<0.05)。與孕酮保護組相比，LY294002處理組GRP78和p-GSK3β表達水平顯著上升(P<0.05)，p-Akt表達水平顯著下降(P<0.05)。
　　6、孕酮部分通過PGRMC1調(diào)控星形膠質(zhì)細胞GRP78、PERK和eIf2α表達
　　WesternBlot結(jié)果顯示：與Aβ1-42誘導(dǎo)的模型組比較，孕酮保護組GRP78、p-PERK和p-eIf2α表達水平顯

18、著下降(P<0.05)；與孕酮保護組相比，AG205處理組GRP78、p-PERK和p-eIf2α表達水平顯著上升(P<0.05)。
　　7、孕酮部分通過PGRMC1調(diào)控星形膠質(zhì)細胞Akt和GSK3β表達
　　WesternBlot結(jié)果顯示：與Aβ1-42誘導(dǎo)的模型組比較，孕酮保護組p-Akt表達水平顯著上升（P<0.05），p-GSK3β表達水平顯著下降（P<0.05）；與孕酮保護組相比，AG205處理組p-Akt表達水平

19、顯著下降（P<0.05），p-GSK3β表達水平顯著上升（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、Aβ1-42能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　2、孕酮通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、PERK和eIf2α的表達減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　3、孕酮可能通過PI3K/Akt/GSK3β信號通路抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　4、孕酮部分通過PGRMC1調(diào)控星