孕酮對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及機制研究.pdf

1、阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）又稱老年癡呆，是以記憶和認知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。β淀粉樣蛋白（β-amyloid, Aβ）在腦內(nèi)大量沉積已經(jīng)被認為是AD致病的最基礎(chǔ)誘發(fā)因素，然而Aβ的神經(jīng)毒性機制尚未完全闡明。最近研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥反應(yīng)在AD病理學(xué)發(fā)展方面起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在AD病理學(xué)改變的早期階段，AD患者腦內(nèi)易感區(qū)域即開始表達上調(diào)炎癥基因并大量合成炎癥細胞因子。大量的流行病學(xué)

2、和隨訪性實驗研究證實抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)能夠降低AD的發(fā)病風險。神經(jīng)炎癥反應(yīng)逐漸被認為是誘發(fā)或加重AD發(fā)展的另一個重要潛在影響因素。
　　星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是數(shù)量最為龐大的一類功能調(diào)節(jié)細胞。在正常生理條件下，星形膠質(zhì)細胞為神經(jīng)元提供必要的營養(yǎng)和信息加工支持，積極參與維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，當星形膠質(zhì)細胞被異?；罨髸罅可舍尫叛装Y調(diào)節(jié)因子，包括促炎癥細胞因子、生長因子、補體化合物、趨化因子等，特別是IL（interleuk

3、in）-1β，IL-6，TNF（tumor necrosis factor）-α等神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)因子的分泌，能夠誘發(fā)或加重腦疾病的發(fā)展惡化。異?；罨男切文z質(zhì)細胞已經(jīng)成為影響神經(jīng)系統(tǒng)功能穩(wěn)定的一大不安因素。值得注意的是，在AD患者的大腦皮層和皮層下結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量異?；罨男切文z質(zhì)細胞。這些活化的星形膠質(zhì)細胞聚集于AD患者腦內(nèi)淀粉樣蛋白和神經(jīng)纖維纏節(jié)周圍，并產(chǎn)生促炎癥調(diào)節(jié)因子。這已經(jīng)構(gòu)成了AD發(fā)病早期出現(xiàn)的重要病理學(xué)現(xiàn)象。這就提示我們，調(diào)節(jié)星

4、形膠質(zhì)細胞功能可能成為治療大腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要靶點。然而，Aβ誘發(fā)星形膠質(zhì)細胞活化后神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生的分子機制尚未完全闡明。因此，全面深入研究神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病中的致病機制，研發(fā)有針對性的AD治療藥物將具有重要現(xiàn)實意義。
　　神經(jīng)甾體是具有神經(jīng)保護活性的甾體類物質(zhì)，主要由膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元在各種甾體生成酶的作用下經(jīng)膽固醇或自外周循環(huán)進入神經(jīng)系統(tǒng)的各種前體合成分泌而成。大量研究表明神經(jīng)甾體不僅參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，還對神經(jīng)系統(tǒng)具有

5、營養(yǎng)支持以及促進神經(jīng)發(fā)生和增加神經(jīng)元存活等作用。神經(jīng)甾體孕酮（progesterone，PG）作為內(nèi)源性神經(jīng)活化甾體，在調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞功能上作用明顯。Bashour等發(fā)現(xiàn)，孕酮可以快速的抑制GnRH神經(jīng)元的活性，調(diào)控神經(jīng)元軸突的生長，調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF的合成與釋放。值得注意的是，當皮下注射給予AD模型大鼠孕酮后發(fā)現(xiàn)，孕酮能顯著改善AD模型大鼠的學(xué)習與記憶功能，然而其對于AD的神經(jīng)保護性機制尚需要進一步闡明。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，

6、孕酮能夠抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體相關(guān)性凋亡，但是對于孕酮調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞功能上的作用尚不得而知。星形膠質(zhì)細胞作為中樞系統(tǒng)中重要的神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)細胞，維持其功能穩(wěn)定對于調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)方面起著重要的作用。
　　本課題以原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞為實驗基礎(chǔ)擬采用Aβ體外誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞過度活化構(gòu)建AD神經(jīng)炎癥細胞模型，討論Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞功能損傷的分子機制，并進一步研究神經(jīng)甾體孕酮對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞功能損傷的神經(jīng)保護性

7、作用及其可能調(diào)控機制。
　　第一部分 Aβ對星形膠質(zhì)細胞的異常活化作用
　　目的：研究Aβ對原代培養(yǎng)皮層星形膠質(zhì)細胞功能的影響，進而評價Aβ對星形膠質(zhì)細胞的異?；罨饔谩?br>　　方法：
　　取新生SD大鼠大腦皮層部位組織進行體外培養(yǎng)，分離純化得到原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，Immofluorescence方法檢測星形膠質(zhì)細胞標志蛋白GFAP以鑒定其純度。分別應(yīng)用Immofluorescence、Western blot、

8、ELISA方法檢測Aβ對星形膠質(zhì)細胞形態(tài)，GFAP蛋白表達，以及促炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α分泌的影響。
　　結(jié)果：
　　1 Aβ促進星形膠質(zhì)細胞促炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α合成分泌
　　應(yīng)用 Aβ處理皮層星形膠質(zhì)細胞不同時間（0h,3h,6h,12h,24h）, ELISA檢測Aβ干預(yù)下星形膠質(zhì)細胞IL-1β，TNF-α分泌水平變化。結(jié)果顯示，Aβ促進星形膠質(zhì)細胞IL-1β，TNF-α的合成分泌，與未

9、干預(yù)組相比， Aβ干預(yù)處理6h后IL-1β，TNF-α分泌水平開始出現(xiàn)顯著性提升。
　　2Aβ在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)大量聚集
　　應(yīng)用 Aβ處理皮層星形膠質(zhì)細胞不同時間（0h,3h,6h,12h），Immofluorescence檢測Aβ在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的動態(tài)變化。結(jié)果顯示，Aβ干預(yù)星形膠質(zhì)細胞3h后在細胞內(nèi)出現(xiàn)Aβ聚集，隨著Aβ干預(yù)時間的延長， Aβ蛋白在細胞內(nèi)的聚集程度持續(xù)增加，在細胞核附近和細胞漿中均有發(fā)現(xiàn)，延緩或阻斷了星形

10、膠質(zhì)細胞自身的降解清除。
　　3Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞形態(tài)異常
　　本部分通過熒光標記星形膠質(zhì)細胞微管相關(guān)蛋白GFAP，觀察星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)改變。Immofluorescence結(jié)果顯示，與未干預(yù)組相比，Aβ干預(yù)處理6h后星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了明顯的形態(tài)改變，主要表現(xiàn)為細胞胞體膨脹，偽足收縮等。
　　4 Aβ上調(diào)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)GFAP蛋白表達
　　為進一步研究Aβ對于星形膠質(zhì)細胞的異?；罨饔?，我們檢測與其活化相關(guān)的

11、GFAP蛋白表達的變化。Western blot檢測結(jié)果顯示，Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞表達GFAP蛋白，與未干預(yù)組相比，當Aβ干預(yù)處理6h后， GFAP蛋白表達出現(xiàn)了顯著性的增加
　　結(jié)論：
　　Aβ誘發(fā)星形膠質(zhì)細胞異?；罨?，并導(dǎo)致促炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α的大量合成分泌。
　　第二部分 Aβ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的機制研究
　　目的：對Aβ引起星形膠質(zhì)細胞活化后炎癥反應(yīng)分子機制的探討，并深入研究外源性炎

12、癥反應(yīng)信號炎癥小體NLRP3對于Aβ所致神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　　新生SD大鼠，取大腦皮層部位組織進行體外培養(yǎng)，分離純化得到原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，分別應(yīng)用Immofluorescence、Western blot方法檢測Aβ對星形膠質(zhì)細胞炎癥小體 NLRP3表達，以及炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白Caspase-1活化的影響。ELISA方法檢測NLRP3/Caspase-1外源性炎癥信號途徑對Aβ所致神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

13、。
　　結(jié)果：
　　1 Aβ促進炎癥小體NLRP3在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)表達
　　應(yīng)用 Aβ處理皮層星形膠質(zhì)細胞不同時間（0h,3h,6h,12h）， Immofluorescence和Western blot檢測星形膠質(zhì)細胞炎癥小體NLRP3蛋白的表達。Immofluorescence結(jié)果顯示，隨著Aβ干預(yù)時間的延長，炎癥小體NLRP3表達逐漸增加，當Aβ干預(yù)6h時，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)NLRP3表達活化出現(xiàn)顯著的提升。West

14、ern blot結(jié)果顯示，Aβ干預(yù)6h后星形膠質(zhì)細胞內(nèi)炎癥小體NLRP3表達相比對照組來說出現(xiàn)了顯著性提高。
　　2 Aβ促進炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白Caspase-1在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的活化
　　我們進一步考察，Aβ對星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白 Caspase-1活化的影響。Western blot結(jié)果顯示，Aβ時間依賴型的促進Caspase-1的成熟，主要表現(xiàn)為Caspase-1 p20片段表達的提升, Aβ干預(yù)6h后Caspa

15、se-1 p20片段出現(xiàn)了顯著性增加，相比對照組來說出現(xiàn)了顯著性差異。當 Aβ干預(yù)時間到達12h后Caspase-1進一步成熟（Caspase-1 p20表達提升），但是相比Aβ干預(yù)6h后Caspase-1 p20表達量并無顯著性差異。
　　3 NLRP3/Caspase-1外源性炎癥信號調(diào)節(jié)Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)
　　我們進一步考察了，NLRP3/Caspase-1外源性炎癥信號對于Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎

16、癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)影響。研究結(jié)果顯示，Aβ干預(yù)處理6h后IL-1β，TNF-α分泌水平明顯提升。與Aβ干預(yù)組相比，Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK顯著性的降低了Aβ誘導(dǎo)下IL-1β、TNF-α的合成分泌。
　　結(jié)論：
　　NLRP3/Caspase-1外源性炎癥信號的激活介導(dǎo)參與Aβ所致星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。
　　第三部分孕酮對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用
　　目的：研究神經(jīng)甾體PG對于Aβ

17、所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，深入探討孕酮可能的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制及相關(guān)炎癥信號途徑。
　　方法：
　　取新生 SD大鼠大腦皮層原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，ELISA方法檢測PG對于Aβ所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。應(yīng)用Western blot方法檢測PG對于Aβ所致星形膠質(zhì)細胞內(nèi)炎癥小體NLRP3表達，以及炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白Caspase-1活化的影響。
　　結(jié)果：
　　1 PG抑制Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞

18、IL-1β、TNF-α的分泌
　　不同濃度PG（0.25、0.5、1、2μM）與Aβ共同處理6h，ELISA檢測在Aβ干預(yù)條件下，不同濃度PG對于星形膠質(zhì)細胞IL-1β、TNF-α分泌水平的影響。結(jié)果顯示，1μM PG能顯著性的下調(diào)Aβ所致星形膠質(zhì)細胞IL-1β、TNF-α的合成分泌。另外，應(yīng)用ELISA檢測在Aβ干預(yù)條件下，PG不同干預(yù)時間對于星形膠質(zhì)細胞IL-1β、TNF-α分泌水平的影響。研究結(jié)果顯示，PG明顯減弱Aβ所致星

19、形膠質(zhì)細胞IL-1β、TNF-α的分泌，與Aβ處理組相比，1μM PG處理6h顯著性的降低了Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞IL-1β、TNF-α的分泌。
　　2 PG調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞Aβ所致NLRP3的表達活化
　　應(yīng)用Western blot檢測Aβ干預(yù)條件下，PG對于星形膠質(zhì)細胞炎癥小體NLRP3表達活化的影響。結(jié)果顯示，PG干預(yù)6h時，Aβ所致的炎癥小體NLRP3表達活化出現(xiàn)顯著的下降，相比Aβ干預(yù)組，炎癥小體NLRP3表達出

20、現(xiàn)了顯著的差異。
　　3 PG調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞Aβ所致Caspase-1的表達活化
　　應(yīng)用 Western blot檢測 Aβ干預(yù)條件下， PG對于星形膠質(zhì)細胞Caspase-1的剪切片段表達的影響（Caspase-1 p20）。結(jié)果顯示，與Aβ干預(yù)組Caspase-1 p20表達量相比，PG干預(yù)6h后顯著性下調(diào)了Aβ所致的Caspase-1 p20的表達活化。
　　結(jié)論：
　　神經(jīng)甾體PG顯著性的抑制Aβ所致

21、NLRP3炎癥小體在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達，并通過下調(diào)Caspase-1的活化抑制Aβ所誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。
　　第四部分自噬對孕酮抑制Aβ所致炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及機制研究
　　目的：
　　研究神經(jīng)甾體PG對于星形膠質(zhì)細胞自噬功能的影響，并進一步討論自噬對于神經(jīng)甾體PG抑制Aβ所致神經(jīng)炎癥反應(yīng)的可能調(diào)節(jié)機制。
　　方法：
　　取新生SD大鼠大腦皮層原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，ELISA方法檢測自噬對 PG抑制 Aβ

22、所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。應(yīng)用 Western blot方法檢測PG對于Aβ所致星形膠質(zhì)細胞自噬功能的調(diào)節(jié)，并檢測自噬對于炎癥小體NLRP3及炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白Caspase-1活化的影響。
　　結(jié)果：
　　1自噬介導(dǎo)PG對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞IL-1β、TNF-α分泌的影響為了深入研究自噬是否介導(dǎo)了PG對Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的保護性機制。應(yīng)用ELISA檢測自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的

23、調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，Rapamycin顯著性的降低了Aβ誘導(dǎo)下IL-1β、TNF-α的合成分泌。自噬抑制劑3-MA明顯的抑制了PG對下IL-1β和TNF-α合成分泌的調(diào)節(jié)作用，相比PG保護組，IL-1β和TNF-α的合成分泌出現(xiàn)了顯著性的升高。
　　2 PG促進Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞自噬啟動
　　為深入探討 PG對于 Aβ干預(yù)下星形膠質(zhì)細胞自噬功能的影響。Western blot結(jié)果顯示，PG激活了星形膠質(zhì)細胞自噬水平，相比

24、Aβ干預(yù)組，LC3-II表達量出現(xiàn)了明顯的提升，并促進了LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)變。與此同時，PG干預(yù)后，Beclin-1表達量也出現(xiàn)了顯著性的提升。
　　3 PG促進Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞自噬活化
　　我們應(yīng)用Western blot檢測自噬降解底物調(diào)節(jié)蛋白P62表達量變化。研究結(jié)果顯示，PG明顯的提升了 Aβ干預(yù)下星形膠質(zhì)細胞自噬功能，相比Aβ干預(yù)組，P62蛋白顯著性的降低。自噬抑制劑3-MA則阻斷了PG對于星形膠質(zhì)

25、細胞自噬功能的活化作用，主要表現(xiàn)為LC3-II表達的下降， LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化降低，以及P62蛋白表達翻轉(zhuǎn)性的增加。
　　4 PG調(diào)節(jié)Aβ誘導(dǎo)下星形膠質(zhì)細胞AKT/mTOR信號
　　為進一步研究PG對于自噬活化功能的影響，我們檢測了星形膠質(zhì)細胞內(nèi)AKT/mTOR信號通路的表達變化。結(jié)果顯示，PG顯著性的抑制了Aβ誘導(dǎo)條件下星形膠質(zhì)細胞AKT/mTOR信號通路。
　　5自噬介導(dǎo)PG調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞Aβ所致NL

26、RP3的表達
　　應(yīng)用Western blot檢測Aβ干預(yù)條件下，自噬對于星形膠質(zhì)細胞炎癥小體NLRP3表達的調(diào)節(jié)作用。自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin，有效的促進了自噬對于Aβ所致炎癥小體NLRP3聚集的降解清除。自噬抑制劑3-MA顯著性的阻斷了PG對于炎癥小體NLRP3的調(diào)節(jié)作用，與PG保護組相比， NLRP3蛋白顯著性的增加。
　　6自噬介導(dǎo)PG調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞Aβ所致Caspase-1的活化
　　為了進一步研究自噬

27、對于炎癥反應(yīng)信號的調(diào)節(jié)作用，我們檢測了炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白Caspase-1的表達水平變化。研究結(jié)果顯示，相比Aβ干預(yù)組星形膠質(zhì)細胞，自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin顯著性的抑制Aβ所致星形膠質(zhì)細胞Caspase-1的活化，表現(xiàn)為Caspase-1 p20/ pro-Caspase-1比例明顯的降低。在PG保護干預(yù)下，Aβ引起的Caspase-1活化同樣被顯著性的抑制。但是自噬抑制劑3-MA則阻斷了PG對于Aβ引起的Caspase-1活化的調(diào)節(jié)

28、作用。
　　結(jié)論：
　　PG能夠明顯的提升 Aβ誘導(dǎo)下星形膠質(zhì)細胞自噬功能，加速了自噬對于自噬底物的處理清除，特別是對于炎癥復(fù)合物小體NLRP3的清除作用，通過調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1炎癥反應(yīng)信號，抑制Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)。
　　綜上所述，本實驗以Aβ干預(yù)原代培養(yǎng)皮層星形膠質(zhì)細胞構(gòu)建AD神經(jīng)炎癥細胞模型，研究神經(jīng)甾體PG對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)的保護性作用及其可能調(diào)控機制。研究發(fā)現(xiàn)，P

29、G能夠明顯抑制 Aβ所致的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，1μM PG處理6h顯著性的降低了Aβ干預(yù)所致的星形膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α的合成分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PG能夠抑制 Aβ引起的星形膠質(zhì)細胞炎癥小體 NLRP3和炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白Caspase-1的表達活化，進而緩解 Aβ引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，提示孕酮通過抑制外源性炎癥信號NLRP3/Caspase-1調(diào)節(jié)Aβ引起的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)；我們還發(fā)現(xiàn)PG能夠上調(diào)Aβ所致星形膠質(zhì)細胞自