Metformin對PTSD大鼠海馬神經(jīng)元AMPK通路的作用及其保護機制的研究.pdf

1、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是由于異常威脅性或災(zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致出現(xiàn)長期持續(xù)性精神障礙，其臨床表現(xiàn)以再度體驗創(chuàng)傷為特征，并伴有情緒的易激惹和回避行為。簡而言之，PTSD是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)[1][2]。近年來，隨著戰(zhàn)爭、社會暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外的不斷增多，PTSD已經(jīng)成為一種普遍的精神障礙而被關(guān)注[3][4]。目前，PTSD及其神經(jīng)生物學(xué)致病機制的探討已

2、成為涉及創(chuàng)傷學(xué)、神經(jīng)精神病學(xué)、心理學(xué)等跨學(xué)科研究的重點[5]。
　　單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)通路通過抑制能量消耗通路和激活能量再生通路，在能源動態(tài)平衡調(diào)控中起著中樞性調(diào)節(jié)作用。AMPK通路可以在生理刺激，例如運動和激素，如脂聯(lián)素，瘦素等，以及病理條件下如缺糖，缺氧，氧化等情況下被激活。作為脂類和血糖代謝調(diào)節(jié)作用的樞紐，AMPK同時被認為是治療肥胖[6-9]，Ⅱ型糖尿病和癌癥的關(guān)鍵靶點[10-15]。一些研究表明AMPK

3、具有神經(jīng)保護作用，目前為止，還沒有關(guān)于AMPK通路對PTSD的保護作用方面的研究。氧化應(yīng)激損傷是創(chuàng)傷后引起PTSD病理變化的誘因。減少和抑制氧化應(yīng)激和其所誘發(fā)的神經(jīng)元調(diào)亡是目前很多對神經(jīng)元保護措施的原理。SPS目前是公認的模擬氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元凋亡的動物模型[16]。本論文的目的旨在研究AMPK通路對海馬神經(jīng)元在氧化應(yīng)激條件下的保護作用和機制。
　　在我國，自然災(zāi)害時有發(fā)生，災(zāi)后一些人會出現(xiàn)長期焦慮與激動情緒。同時隨著社會的發(fā)展

4、、生活的節(jié)奏加快，來自外界的壓力不斷增大，這些均成為PTSD誘發(fā)因素。因而如何治療PTSD是一個刻不容緩的課題。因此，本課題引用國際上公認的SPS做為PTSD動物模型來進行PTSD的基礎(chǔ)研究，首次揭示PTSD海馬細胞凋亡與AMPK通路的關(guān)系，以及AMPK通路的激動劑成為今后防治這一疾病的有效途徑。
　　目的:
　　本研究主要通過使用本實驗室有多年研究經(jīng)驗的SPS誘導(dǎo)的大鼠PTSD模型，觀察Metformin對海馬神經(jīng)元AMP

5、K通路的激活、線粒體、凋亡和氧化應(yīng)激在蛋白和RNA水平的分子生物學(xué)影響，來研究Metformin是否有可能對PTSD有保護作用。為今后進一步進行Metformin對PTSD行為學(xué)和細胞學(xué)的影響打下堅實基礎(chǔ)。由于分子學(xué)改變的時間周期短，本研究觀察時間點局限在SPS后4天內(nèi)。
　　方法:
　　1、模型制作及分組
　　采用國際公認的SPS刺激誘發(fā)的PTSD模型[17][18]。SPS刺激是指將大鼠連續(xù)進行下述步驟處理，即:大

6、鼠禁錮2h后，立即強迫游泳20min(水深40cm，水溫25℃)。經(jīng)過15min的恢復(fù)，乙醚麻醉至意識喪失，在籠子中不再經(jīng)任何刺激正常飼養(yǎng)至取材。隨機分為4組，對照組、SPS組、Metformin組、SPS+Metformin組。隨后在需要的時間將大鼠安樂死后取海馬組織。
　　由于本研究主要聚焦于Metformin對SPS后海馬神經(jīng)元分子生物學(xué)的影響，因此，Metformin對海馬神經(jīng)元影響的實驗樣本的采集時間為皮下注射后0、1、

7、2和4天。Metformin對SPS后海馬神經(jīng)元影響的實驗樣本采集時間為Metformin給藥后一天，SPS在Metformin給藥后一小時進行。
　　2、給藥方式和劑量
　　根據(jù)Metformin給藥的相關(guān)文獻，以及本人之前在小鼠Metformin給藥實驗中的研究初步結(jié)果，證明采用腹部皮下注射方法可以有效降低血糖，因此在本預(yù)實驗中采用了大鼠腹部皮下注射Metformin300mg、400mg和500mg每公斤體重，預(yù)實驗表

8、明在300mg和400mg每公斤的劑量沒有觀察到對大鼠行為有影響，500mg每公斤體重出現(xiàn)部分大鼠短時間的行動障礙，分析可能由于引起大鼠的血糖降低，故本實驗采用400mg/kg劑量。
　　3、Western blotting檢測海馬神經(jīng)元的pAMPKa、PGC-1a和PARP
　　取海馬神經(jīng)元的組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心，提取上清蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，經(jīng)封閉后分別加一抗(MR工作濃度1∶2000)4℃過夜;HRP標記Ig

9、G(工作濃度1∶5000)孵育2h，DAB法顯色，掃描各條帶計算光密度值。
　　4、Real-time PCR檢測海馬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷和線粒體合成相關(guān)基因。
　　大鼠在完成實驗后，分離海馬組織，提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，應(yīng)用經(jīng)過檢測efficiency大于90％預(yù)先合成的引物和配套的試劑，進行real-time PCR半定量檢測。
　　結(jié)果:
　　1、Metformin激活PTSD-SPS海馬神經(jīng)

10、元AMPK通路Western Blotting分析結(jié)果顯示:
　　與正常對照組相比，Metformin組海馬磷酸化AMPK和AMPK通路下游調(diào)節(jié)能量代謝的重要樞紐蛋白，PGC-1a蛋白表達水平明顯增加，在Metformin皮下給藥(400mg/kg)一天后，活化AMPK和PGC-1a表達增加到1.5倍。在給藥兩天后增加到2倍以上，持續(xù)給藥在第三天時仍然維持在2倍左右水平，說明體內(nèi)藥物濃度可能達到了平臺期。
　　與正常對照組相

11、比，Metformin給藥后6小時和1天對比，給藥6小時組活化AMPK的表達和PGC-1沒有顯著增加，而1天后兩者均見顯著上調(diào)，包括Metformin組和SPS+Metformin組，SPS組未見顯著變化。
　　2、AMPK通路激活對PTSD大鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷的保護作用
　　Real-time PCR結(jié)果分析顯示:
　　與正常對照組相比，PGC-1a在給藥一天后，Metformin組未見mRNA表達出現(xiàn)明顯表達增

12、加，但在SPS組出現(xiàn)PGC-1a表達水平出現(xiàn)顯著下降，同時在有Metformin干預(yù)時，將SPS誘導(dǎo)的PGC-1a的表達下降阻斷。
　　與正常對照組相比，給藥6小時后，Metformin組、SPS組、SPS+Metformin組PGC-1a mRNA表達水平均未見顯著變化。
　　線粒體功能相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子TFAM和NRF-1，均為PGC-1a調(diào)節(jié)的下游轉(zhuǎn)錄因子，均出現(xiàn)與PGC-1a表達一致的表現(xiàn)。即在給藥一天后，SPS組出

13、現(xiàn)明顯降低，而Metformin的應(yīng)用抑制了這種降低。
　　3、Metformin促進了海馬神經(jīng)元線粒體DNA復(fù)制
　　Real-time PCR結(jié)果分析顯示:
　　通過對比細胞核內(nèi)特異性基因的表達和線粒體DNA特異性基因COXII的表達，可以間接檢測線粒體DNA含量。給藥一天后海馬神經(jīng)元線粒體DNA的復(fù)制出現(xiàn)顯著增加，達到正常對照組的1.5倍左右，其后給藥2天到4天增加到大約2倍水平，但1、2、4天組未見顯著變化。<

14、br>　　4、Metformin對PTSD大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡的保護作用。
　　Western blotting結(jié)果分析顯示:
　　與正常對照組相比，Metformin組未明顯改變體內(nèi)細胞凋亡的標志蛋白之一，DNA修復(fù)酶，PARP蛋白水平表達，而SPS組出現(xiàn)了明顯的表達增加，而給藥Metformin后避免了SPS誘導(dǎo)的PARP表達增加。
　　5、Metformin對PTSD大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護作用。

15、　　Real-time PCR結(jié)果分析顯示:
　　與細胞內(nèi)DNA損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的重要基因包括PARP14、GADD45B、TXNRD1的mRNA表達水平在不同分組的結(jié)果顯示，Metformin對所有基因的表達沒有明顯影響，SPS可以誘導(dǎo)三種基因表達水平均明顯上調(diào)，而給藥Metfromin后有效預(yù)防了三種基因的表達增加，表明Metformin預(yù)防了SPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　1、Metf