Metformin對(duì)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元AMPK通路的作用及其保護(hù)機(jī)制的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder,PTSD)是由于異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷導(dǎo)致出現(xiàn)長(zhǎng)期持續(xù)性精神障礙,其臨床表現(xiàn)以再度體驗(yàn)創(chuàng)傷為特征,并伴有情緒的易激惹和回避行為。簡(jiǎn)而言之,PTSD是一種創(chuàng)傷后心理失衡狀態(tài)[1][2]。近年來(lái),隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外的不斷增多,PTSD已經(jīng)成為一種普遍的精神障礙而被關(guān)注[3][4]。目前,PTSD及其神經(jīng)生物學(xué)致病機(jī)制的探討已

2、成為涉及創(chuàng)傷學(xué)、神經(jīng)精神病學(xué)、心理學(xué)等跨學(xué)科研究的重點(diǎn)[5]。
  單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)通路通過抑制能量消耗通路和激活能量再生通路,在能源動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控中起著中樞性調(diào)節(jié)作用。AMPK通路可以在生理刺激,例如運(yùn)動(dòng)和激素,如脂聯(lián)素,瘦素等,以及病理?xiàng)l件下如缺糖,缺氧,氧化等情況下被激活。作為脂類和血糖代謝調(diào)節(jié)作用的樞紐,AMPK同時(shí)被認(rèn)為是治療肥胖[6-9],Ⅱ型糖尿病和癌癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)[10-15]。一些研究表明AMPK

3、具有神經(jīng)保護(hù)作用,目前為止,還沒有關(guān)于AMPK通路對(duì)PTSD的保護(hù)作用方面的研究。氧化應(yīng)激損傷是創(chuàng)傷后引起PTSD病理變化的誘因。減少和抑制氧化應(yīng)激和其所誘發(fā)的神經(jīng)元調(diào)亡是目前很多對(duì)神經(jīng)元保護(hù)措施的原理。SPS目前是公認(rèn)的模擬氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元凋亡的動(dòng)物模型[16]。本論文的目的旨在研究AMPK通路對(duì)海馬神經(jīng)元在氧化應(yīng)激條件下的保護(hù)作用和機(jī)制。
  在我國(guó),自然災(zāi)害時(shí)有發(fā)生,災(zāi)后一些人會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)期焦慮與激動(dòng)情緒。同時(shí)隨著社會(huì)的發(fā)展

4、、生活的節(jié)奏加快,來(lái)自外界的壓力不斷增大,這些均成為PTSD誘發(fā)因素。因而如何治療PTSD是一個(gè)刻不容緩的課題。因此,本課題引用國(guó)際上公認(rèn)的SPS做為PTSD動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行PTSD的基礎(chǔ)研究,首次揭示PTSD海馬細(xì)胞凋亡與AMPK通路的關(guān)系,以及AMPK通路的激動(dòng)劑成為今后防治這一疾病的有效途徑。
  目的:
  本研究主要通過使用本實(shí)驗(yàn)室有多年研究經(jīng)驗(yàn)的SPS誘導(dǎo)的大鼠PTSD模型,觀察Metformin對(duì)海馬神經(jīng)元AMP

5、K通路的激活、線粒體、凋亡和氧化應(yīng)激在蛋白和RNA水平的分子生物學(xué)影響,來(lái)研究Metformin是否有可能對(duì)PTSD有保護(hù)作用。為今后進(jìn)一步進(jìn)行Metformin對(duì)PTSD行為學(xué)和細(xì)胞學(xué)的影響打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。由于分子學(xué)改變的時(shí)間周期短,本研究觀察時(shí)間點(diǎn)局限在SPS后4天內(nèi)。
  方法:
  1、模型制作及分組
  采用國(guó)際公認(rèn)的SPS刺激誘發(fā)的PTSD模型[17][18]。SPS刺激是指將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理,即:大

6、鼠禁錮2h后,立即強(qiáng)迫游泳20min(水深40cm,水溫25℃)。經(jīng)過15min的恢復(fù),乙醚麻醉至意識(shí)喪失,在籠子中不再經(jīng)任何刺激正常飼養(yǎng)至取材。隨機(jī)分為4組,對(duì)照組、SPS組、Metformin組、SPS+Metformin組。隨后在需要的時(shí)間將大鼠安樂死后取海馬組織。
  由于本研究主要聚焦于Metformin對(duì)SPS后海馬神經(jīng)元分子生物學(xué)的影響,因此,Metformin對(duì)海馬神經(jīng)元影響的實(shí)驗(yàn)樣本的采集時(shí)間為皮下注射后0、1、

7、2和4天。Metformin對(duì)SPS后海馬神經(jīng)元影響的實(shí)驗(yàn)樣本采集時(shí)間為Metformin給藥后一天,SPS在Metformin給藥后一小時(shí)進(jìn)行。
  2、給藥方式和劑量
  根據(jù)Metformin給藥的相關(guān)文獻(xiàn),以及本人之前在小鼠Metformin給藥實(shí)驗(yàn)中的研究初步結(jié)果,證明采用腹部皮下注射方法可以有效降低血糖,因此在本預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用了大鼠腹部皮下注射Metformin300mg、400mg和500mg每公斤體重,預(yù)實(shí)驗(yàn)表

8、明在300mg和400mg每公斤的劑量沒有觀察到對(duì)大鼠行為有影響,500mg每公斤體重出現(xiàn)部分大鼠短時(shí)間的行動(dòng)障礙,分析可能由于引起大鼠的血糖降低,故本實(shí)驗(yàn)采用400mg/kg劑量。
  3、Western blotting檢測(cè)海馬神經(jīng)元的pAMPKa、PGC-1a和PARP
  取海馬神經(jīng)元的組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心,提取上清蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,經(jīng)封閉后分別加一抗(MR工作濃度1∶2000)4℃過夜;HRP標(biāo)記Ig

9、G(工作濃度1∶5000)孵育2h,DAB法顯色,掃描各條帶計(jì)算光密度值。
  4、Real-time PCR檢測(cè)海馬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷和線粒體合成相關(guān)基因。
  大鼠在完成實(shí)驗(yàn)后,分離海馬組織,提取總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,應(yīng)用經(jīng)過檢測(cè)efficiency大于90%預(yù)先合成的引物和配套的試劑,進(jìn)行real-time PCR半定量檢測(cè)。
  結(jié)果:
  1、Metformin激活PTSD-SPS海馬神經(jīng)

10、元AMPK通路Western Blotting分析結(jié)果顯示:
  與正常對(duì)照組相比,Metformin組海馬磷酸化AMPK和AMPK通路下游調(diào)節(jié)能量代謝的重要樞紐蛋白,PGC-1a蛋白表達(dá)水平明顯增加,在Metformin皮下給藥(400mg/kg)一天后,活化AMPK和PGC-1a表達(dá)增加到1.5倍。在給藥兩天后增加到2倍以上,持續(xù)給藥在第三天時(shí)仍然維持在2倍左右水平,說明體內(nèi)藥物濃度可能達(dá)到了平臺(tái)期。
  與正常對(duì)照組相

11、比,Metformin給藥后6小時(shí)和1天對(duì)比,給藥6小時(shí)組活化AMPK的表達(dá)和PGC-1沒有顯著增加,而1天后兩者均見顯著上調(diào),包括Metformin組和SPS+Metformin組,SPS組未見顯著變化。
  2、AMPK通路激活對(duì)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元線粒體損傷的保護(hù)作用
  Real-time PCR結(jié)果分析顯示:
  與正常對(duì)照組相比,PGC-1a在給藥一天后,Metformin組未見mRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯表達(dá)增

12、加,但在SPS組出現(xiàn)PGC-1a表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下降,同時(shí)在有Metformin干預(yù)時(shí),將SPS誘導(dǎo)的PGC-1a的表達(dá)下降阻斷。
  與正常對(duì)照組相比,給藥6小時(shí)后,Metformin組、SPS組、SPS+Metformin組PGC-1a mRNA表達(dá)水平均未見顯著變化。
  線粒體功能相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子TFAM和NRF-1,均為PGC-1a調(diào)節(jié)的下游轉(zhuǎn)錄因子,均出現(xiàn)與PGC-1a表達(dá)一致的表現(xiàn)。即在給藥一天后,SPS組出

13、現(xiàn)明顯降低,而Metformin的應(yīng)用抑制了這種降低。
  3、Metformin促進(jìn)了海馬神經(jīng)元線粒體DNA復(fù)制
  Real-time PCR結(jié)果分析顯示:
  通過對(duì)比細(xì)胞核內(nèi)特異性基因的表達(dá)和線粒體DNA特異性基因COXII的表達(dá),可以間接檢測(cè)線粒體DNA含量。給藥一天后海馬神經(jīng)元線粒體DNA的復(fù)制出現(xiàn)顯著增加,達(dá)到正常對(duì)照組的1.5倍左右,其后給藥2天到4天增加到大約2倍水平,但1、2、4天組未見顯著變化。<

14、br>  4、Metformin對(duì)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡的保護(hù)作用。
  Western blotting結(jié)果分析顯示:
  與正常對(duì)照組相比,Metformin組未明顯改變體內(nèi)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白之一,DNA修復(fù)酶,PARP蛋白水平表達(dá),而SPS組出現(xiàn)了明顯的表達(dá)增加,而給藥Metformin后避免了SPS誘導(dǎo)的PARP表達(dá)增加。
  5、Metformin對(duì)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

15、  Real-time PCR結(jié)果分析顯示:
  與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的重要基因包括PARP14、GADD45B、TXNRD1的mRNA表達(dá)水平在不同分組的結(jié)果顯示,Metformin對(duì)所有基因的表達(dá)沒有明顯影響,SPS可以誘導(dǎo)三種基因表達(dá)水平均明顯上調(diào),而給藥Metfromin后有效預(yù)防了三種基因的表達(dá)增加,表明Metformin預(yù)防了SPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。
  結(jié)論:
  1、Metf

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