線粒體Rho蛋白1對無鎂致癇大鼠海馬神經(jīng)元的作用及其機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　癲癇(epilepsy, EP)是由多種原因引起的，以反復出現(xiàn)神經(jīng)元異常放電所致的短暫性腦功能障礙為特征的一組病變。長期、反復發(fā)作的癲癇嚴重影響著患者的生活和工作，也給家庭，社會帶來了較大的負面影響。癲癇發(fā)病機制的復雜性，使得至今尚未能了解其全部機制，因而進一步明確癲癇的發(fā)病機理及尋求新的診治靶點具有重要意義。
　　線粒體具有為細胞生理活動提供能量和調(diào)控信號傳導等重要作用。因此近年來成為癲癇發(fā)病機制的研究熱

2、點。以往研究經(jīng)證實癲癇發(fā)作可使線粒體功能受損，造成大量的變性蛋白質(zhì)和受損細胞器堆積在細胞內(nèi)。同時使損傷的線粒體膜電位降低，并發(fā)生通透性轉(zhuǎn)運，釋放凋亡相關(guān)因子，最終引起細胞凋亡，形成神經(jīng)元對癲癇損傷更加敏感的惡性循環(huán)。因此，及時清除受損線粒體和維持線粒體正常功能顯得至關(guān)重要。
　　線粒體移動在清除受損線粒體和維持線粒體正常功能中發(fā)揮重要作用:線粒體移動可將受損線粒體逆行運動至胞體被降解和回收，同時將正常線粒體順向運動至神經(jīng)元的作用部

3、位而發(fā)揮功能，以保證病理狀態(tài)下線粒體在細胞中占領(lǐng)正確的位置及分布，來應對病理損傷。然而，關(guān)于線粒體是如何移動的機制并不明確，一些相關(guān)研究證實存在一部分與線粒體移動密切相關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)分子，如為線粒體移動提供驅(qū)動力的馬達分子Kinesin（驅(qū)動蛋白）、Dynein（動力蛋白）和Myosin（肌球蛋白）；將馬達分子與線粒體相連的銜接蛋白如Miro1/2（mitochondrial Rho-GTPase1/2）、Milton和Syntabulin

4、。Miro蛋白是小GTPase家族中的一員，它的N端和C端各有一個GTPase結(jié)構(gòu)域，同時含有與Ca2+相結(jié)合的EF手型結(jié)構(gòu)域，其通過C端跨膜區(qū)域與線粒體定向結(jié)合。以往研究發(fā)現(xiàn)，Miro可與Milton形成復合物，然后與Kinesin肌球重鏈（KHC）連接，進而調(diào)控線粒體沿微管的快速移動。
　　目前，大量國內(nèi)外研究證實癲癇過程中存在線粒體功能及結(jié)構(gòu)損傷。但線粒體移動異常在癲癇神經(jīng)元線粒體功能結(jié)構(gòu)受損中發(fā)揮何種作用；能否通過調(diào)控線粒

5、體移動而發(fā)揮神經(jīng)保護作用仍然未知。因此，本課題在前期實驗的基礎(chǔ)上,通過體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元及無鎂誘導建立癲癇放電模型，同時構(gòu)建腺病毒真核表達質(zhì)粒干預Miro1表達，通過觀察Miro1介導的線粒體移動對無鎂致癇的海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)、細胞活性、神經(jīng)元損傷和凋亡的影響，探討是否通過調(diào)控線粒體移動，減少線粒體損傷，抗凋亡級聯(lián)發(fā)揮癲癇神經(jīng)保護作用，并通過檢測神經(jīng)元中Bax、caspase-3及Bcl-2表達水平的變化，初步探討其中的可能機制。<

6、br>　　材料與方法：
　　取新生24h內(nèi)Sprague-Dawley大鼠，75％酒精浸泡消毒后，斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬組織，制成單細胞懸液，體外進行大鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。于倒置相差顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元在培養(yǎng)過程中的形態(tài)學變化，選取培養(yǎng)至10d的神經(jīng)元細胞，采用免疫熒光的方法進行神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）神經(jīng)元純度鑒定。同時構(gòu)建表達大鼠Miro1基因的重組腺病毒真核表達質(zhì)粒

7、（rAd-Miro1）以及不表達任何外源基因的對照腺病毒載體(rAd)，并鑒定。取培養(yǎng)至14d的海馬神經(jīng)元隨機分為對照組（CON組）、無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組四組，后三組按照Sombati細胞模型方法，進行無鎂細胞外液處理3h后恢復至正常細胞培養(yǎng)液，其中無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組在無鎂細胞外液誘導前48h分別轉(zhuǎn)染rAd及 rAd-Miro1進行預處理。造模成功

8、24h后通過MTS試劑盒分別測定各組海馬神經(jīng)元細胞活性變化，取各組中部分細胞采用TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡情況，剩余細胞采用QT-PCR法測定Miro1 mRNA的表達，Western blot法檢測Miro1、Bax、Bcl-2及Caspase3的表達。
　　結(jié)果：
　　1．細胞形態(tài)學觀察：倒置差相顯微鏡下可觀察到剛種植于細胞培養(yǎng)板內(nèi)的大鼠海馬神經(jīng)元為較小體積的單個細胞，呈圓形，飽滿，透亮，且散在分布。部分神經(jīng)元細胞在培養(yǎng)

9、3h后開始貼壁，幾乎所有的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)至24h后均貼壁生長，并且有明顯的長短不一的突起長出。培養(yǎng)至7d時，典型的神經(jīng)元軸突與樹突即可被觀察到，且胞體立體感強，細胞核呈空泡狀，但神經(jīng)元與神經(jīng)元之間尚未形成突觸，大多為單個細胞。培養(yǎng)至10d左右大鼠海馬神經(jīng)元之間開始形成網(wǎng)狀聯(lián)系。培養(yǎng)至14d時神經(jīng)元胞體最大，軸突、樹突清晰，細胞間網(wǎng)絡變得密集。培養(yǎng)至至4w時，維持液中開始有大量細胞碎片出現(xiàn)，細胞逐漸凋亡。
　　2．海馬神經(jīng)元純度鑒定

10、：取培養(yǎng)至10d的海馬神經(jīng)元細胞爬片，采用免疫熒光細胞化學方法進行鑒定，結(jié)果顯示：海馬神經(jīng)元純度達93.1%。
　　3．神經(jīng)元活性測定：MTS試劑盒測定細胞活性結(jié)果顯示，與CON組相比，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組三組大鼠海馬神經(jīng)元細胞活性下降，差異均具有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組海馬神經(jīng)元細胞活性升高，差異有統(tǒng)計學意義，無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組海馬神經(jīng)

11、元細胞活性下降，差異無統(tǒng)計學意義。
　　4．病理學檢測：TUNEL法結(jié)果顯示，與對照組相比，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組3組中凋亡的大鼠海馬神經(jīng)元中數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組凋亡的大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義，無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組凋亡的大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目增多，差異無統(tǒng)計學意義。
　　5．QT-PCR結(jié)果：與CON組相

12、比，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組三組大鼠海馬神經(jīng)元無鎂誘導后24h Miro1 mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組，Miro1 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義；無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組Miro1 mRNA水平升高，差異無統(tǒng)計學意義。
　　6．Western blot結(jié)果：與CON組比較，Miro1蛋白表達量在無鎂誘導后3h開始升高

13、，24h時達最高水平，差異有統(tǒng)計學意義；與CON組比較，無鎂誘導組、無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組和無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組三組大鼠海馬神經(jīng)元無鎂誘導后24h Miro1水平均顯著升高，Bcl-2表達下降，caspase-3和Bax的激活均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義；與無鎂誘導組相比，無鎂誘導+rAd-Miro1轉(zhuǎn)染組Miro1水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義；無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組Miro1水平升高，差異無統(tǒng)計學意義；無鎂誘導+rA

14、d-Miro1轉(zhuǎn)染組Bcl-2表達升高，Bax和caspase-3激活減少，差異均具有統(tǒng)計學意義，無鎂誘導+rAd轉(zhuǎn)染組Bcl-2表達升高，Bax和caspase-3激活減少，差異均無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1．無鎂誘導大鼠海馬神經(jīng)元致癇后細胞內(nèi)Miro1 mRNA及Miro1蛋白的表達水平均提高，提示線粒體移動可能參與癲癇病理損傷的過程；
　　2．Miro1蛋白介導的線粒體移動對癲癇發(fā)作后的大鼠海馬神經(jīng)元具有保