NAP對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用.pdf

1、癲癇(epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，嚴重危害人類健康，給社會、家庭和個人都帶了來沉重的負擔，我國目前約有900萬癲癇患者，患病率為5‰～7‰，其中約有20％-40％的患者用現(xiàn)有的抗癲癇治療方法不能很好地控制發(fā)作，演變?yōu)殡y治性癲癇，顳葉癲癇(temporallobeepilepsy,TLE)是其中最常見的類型。近年來對對TLE的病因、病理及發(fā)病機制的研究取得了巨大進展，但其發(fā)病機制目前尚未完全闡明，藥物及手術治療均難以取得明顯療效

2、。氯化鋰一匹羅卡品致癇大鼠行為學、神經(jīng)電生理學和海馬神經(jīng)元損傷的病理學改變均與人類顳葉癲癇相似，因此是目前研究癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus，SE)和TLE的常用模型之一。反復癲癇發(fā)作能造成神經(jīng)元損傷已被廣泛認可，但癲癇發(fā)作致神經(jīng)元損傷的分子生物學機制目前仍不十分清楚。因此進一步探討癲癇的病因及發(fā)病機制，探索新的神經(jīng)保護藥物及潛在作用機制，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　 NAP(napvsipq)是一種人工合

3、成的辛肽化合物，是活性依賴性神經(jīng)保護蛋白（activity-dependentneuroprotectiveprotein,ADNP）的活性肽段[1-4]，它的發(fā)現(xiàn)源于對血管活性腸肽(vasoactiveintestinalpeptide,VIP)的研究[5，6]，后者是一種肽能神經(jīng)遞質，可以刺激神經(jīng)膠質細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)素包括ADNP。NAP已經(jīng)被證實在極低濃度（毫克每千克體重）即具有很強的生物活性，它可以對抗由β淀粉樣蛋白(Aβ)、興

4、奮性毒素NMDA、電阻滯、HIV衣殼蛋白(GP120)、多巴胺、H2O2和鋅超載等所引起的細胞損傷;NAP還可以保護ApoE敲除的大鼠、閉合性腦損傷、胎兒酒精中毒和中風的大鼠的大腦神經(jīng)元免受損傷[7,8]，在不可逆的局部腦缺血模型中，發(fā)現(xiàn)應用NAP可以減少梗死面積，顯著降低凋亡神經(jīng)元數(shù)目[9]。近年來，對NAP的神經(jīng)保護作用機制的研究也日益深入，有研究提示NAP可以通過介導線粒體凋亡途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　 NAP具有抗凋亡

5、及神經(jīng)保護作用已被廣泛認可，但其是否能在癲癇引起的腦損傷中發(fā)揮保護作用目前研究甚少。因此，本課題建立氯化鋰—匹羅卡品致癇大鼠模型，探討癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元損傷的病理學特征及分子生物學改變;檢測腹腔給予外源性NAP對匹羅卡品致癇后大鼠海馬神經(jīng)元線粒體凋亡通路相關蛋白水平的變化及氧化應激水平的改變，深入探討NAP對癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元是否具有保護作用及其可能的機制。本研究分兩個部分:
　　 第一部分:
　　 氯化鋰-匹魯卡品

6、大鼠急性癲癇模型的建立及對海馬神經(jīng)元損傷的病理學和分子學觀察
　　 目的:
　　 1.建立氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)的大鼠顳葉癲癇的模型。
　　 2.觀察氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠行為學及海馬組織病理學改變。
　　 3.研究氯化鋰-匹羅卡品致癇后不同時間點大鼠海馬線粒體凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和活性caspase-3水平的變化，進一步探討癲癇后大鼠海馬神經(jīng)元損傷的分子生物學機制。
　　 4.研究氯化

7、鋰-匹魯卡品致癇后不同時間點大鼠海馬氧化應激水平的改變。
　　 方法:
　　 1.健康成年雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、癲癇組，后者又分為癲癇發(fā)作后2h、6h、16h、24h和72h組
　　 2.癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)SE，觀察大鼠行為學改變，SE持續(xù)60min后腹腔注射地西泮終止發(fā)作。
　　 3.癲癇組各組部分大鼠在相應的時間點斷頭取腦，分離海馬，提取蛋白，Westernblo

8、t法檢測各組大鼠海馬Bax、Bcl-2和活性caspase-3的水平。
　　 4.癲癇組各組剩余大鼠在相應的時間點斷頭取腦，分離海馬，制成細胞懸液，酶標儀測細胞氧化應激水平。
　　 5.癲癇發(fā)作后24h組，用多聚甲醛灌注取腦，石蠟包埋、切片，HE和Nissl染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediatedd

9、UTPnickend-labeling,TUNEL)法檢測細胞凋亡。
　　 結果:
　　 1.根據(jù)Racine發(fā)作評分標準，發(fā)作達到Ⅳ-Ⅴ級的大鼠被認為是誘發(fā)SE成功（表現(xiàn)為雙側前肢的陣攣、抽搐及全面性強直.陣攣發(fā)作，雙側后肢強直伴身體直立、軀干背曲強直、跌倒）。氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)大鼠SE成功率為89.3％，潛伏期39.5+18.6min。
　　 2.HE和Nissl染色顯示:正常大鼠海馬CA1和CA3區(qū)錐體細

10、胞排列整齊，細胞結構清晰完整，細胞核結構正常，染色質分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富;癲癇組大鼠海馬的CA1和CA3區(qū)部分神經(jīng)元丟失，排列疏松，細胞輪廓模糊，細胞結構不清，部分神經(jīng)元胞體皺縮，核固縮，胞漿深染，胞漿內(nèi)尼氏小體減少。
　　 3.正常組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)TUNEL染色未見陽性細胞，癲癇組大鼠在SE后24hTUNEL染色陽性細胞較正常組大鼠明顯增加((P)＜0.05)。
　　 4.較正常組相比，癲癇組大鼠海馬

11、Bax的表達顯著增高(p＜0.05），而Bcl-2的水平則明顯降低(p＜0.05）;癲癇發(fā)作早期caspase-3無活性，直到癲癇發(fā)作后24hcaspase-3才被激活(p＜0.05)。
　　 5.SE細胞內(nèi)ROS水平升高，3h升高明顯，6h達到高峰
　　 結論:
　　 根據(jù)氯化鋰-匹魯卡品腹腔注射后大鼠的行為學改變說明氯化鋰-匹魯卡品腹腔注射可致大鼠急性癲癇發(fā)作（即SE），氯化鋰-匹魯卡品致癇后可以引起大鼠海馬

12、神經(jīng)元的損傷、細胞內(nèi)氧化應激水平的改變和細胞凋亡，細胞凋亡可以通過調節(jié)線粒體凋亡途徑引起。本研究闡明了癲癇后海馬神經(jīng)元損傷的可能分子生物學機制，為進一步研究癲癇的神經(jīng)保護治療提供理論依據(jù)。
　　 第二部分:
　　 神經(jīng)保護多肽NAP對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用
　　 目的:
　　 研究神經(jīng)保護肽NAPVSIPQ對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元線粒體凋亡相關蛋白表達水平和細胞內(nèi)氧化應激

13、水平的影響，進一步探討NAPVSIPQ對癲癇后海馬神經(jīng)元的保護作用及其可能的機制
　　 方法:
　　 1.成年雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、匹魯卡品組、匹魯卡品+生理鹽水組和匹魯卡品+NAP組，觀察各組大鼠的行為學差異。
　　 2.癲癇發(fā)作后24h灌注取腦、Nissl染色觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況，并且測定海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)。
　　 3.癲癇發(fā)作后24h斷頭取腦，分離海馬，We

14、sternblot法測定各組海馬Bax、Bcl-2和活性caspase-3的水平。
　　 4.癲癇發(fā)作后24h斷頭取腦，分離海馬，酶標儀檢測各組海馬細胞內(nèi)氧化應激水平。
　　 結果:
　　 1.NAP對匹魯卡品誘發(fā)的大鼠癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作程度及急性期死亡率沒有明顯影響。
　　 2.Nissl染色顯示正常大鼠海馬CA1和CA3區(qū)細胞結構排列整齊緊密，細胞結構清晰，細胞核結構清晰，染色質分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏

15、小體豐富。癲癇發(fā)作后24h大鼠海馬CA1和CA3區(qū)細胞排列紊亂、部分神經(jīng)元丟失，胞質濃縮，核固縮，染色質分布不均，胞質內(nèi)尼氏小體減少。NAP干預的大鼠海馬CA1和CA3區(qū)細胞結構完整，少量細胞出現(xiàn)染色質凝集現(xiàn)象。較正常對照組，癲癇發(fā)作后24h神經(jīng)元存活數(shù)明顯減少(p＜0.05)，而NAP顯著減少了癲癇導致的神經(jīng)元丟失(p＜0.05)，而匹魯卡品組和匹魯卡品+生理鹽水組神經(jīng)元存活數(shù)無明顯差異。
　　 3.與匹魯卡品組相比，NAP+

16、匹魯卡品組大鼠海馬Bcl-2水平明顯升高(p＜0.05)，而Bax和活性caspase-3水平顯著降低(p＜0.05)。匹魯卡品+生理鹽水組上述指標水平與匹魯卡品組無明顯差異。
　　 4.與匹魯卡品組相比，NAP預注射組大鼠SE6h后海馬氧化應激水平明顯降低(p＜0.05)。
　　 結論:
　　 NAPVSIPQ可以上調Bcl-2/Bax水平，抑制caspase-3的激活，從而通過抑制線粒體凋亡途徑抑制氯化鋰-匹

17、魯卡品致癇大鼠癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元凋亡，同時可以降低細胞內(nèi)氧化應激水平，減輕氧化應激損傷，從而減輕癲癇導致的海馬神經(jīng)元損傷，也為癲癇后神經(jīng)元保護治療提供新的治療靶點。
　　 研究意義:
　　 本研究用氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作作為顳葉癲癇的大鼠模型，深入研究了線粒體凋亡通路和氧化應激損傷在癲癇發(fā)作導致致的海馬神經(jīng)元損傷中所起的作用，第一次證實了ADNF活性神經(jīng)短肽NAPVSIPQ在氯化鋰-匹魯卡品所致的癲癇中通過調