遠(yuǎn)志皂苷對β淀粉樣蛋白1-40誘導(dǎo)AD大鼠海馬神經(jīng)元線粒體的保護(hù)作用與機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)功能受損為主要臨床特征的神經(jīng)退行性疾病,是一種老年性疾病,與機(jī)體和年齡的老化密切相關(guān)。其病理特征表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)、細(xì)胞外存在老年斑以及神經(jīng)元缺失,且主要分布在前皮質(zhì)和海馬區(qū)。隨著全球老齡化步伐的加快,阿爾茨海默病對人類的威脅越來越大,但由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,具體病因目前尚不清楚,治療上也缺乏有效的方法和手段,因此需深入的研究。

2、　　目的:
　　線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器,近年來被視為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵元件,許多凋亡事件集中在線粒體上,對細(xì)胞存亡起著調(diào)控開關(guān)的作用。線粒體對衰老、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生機(jī)理是目前學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)之一。本課題擬通過將凝聚態(tài)Aβ1-40注射到大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)建立AD動物模型后,觀察大鼠海馬神經(jīng)元線粒體病理形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、膜電位、膜蛋白等方面的變化與表達(dá),綜合探討線粒體功能異常與AD發(fā)生的關(guān)系,以及通過研究益智中藥遠(yuǎn)志有效成分

3、遠(yuǎn)志皂苷對線粒體保護(hù)機(jī)制以為今后臨床應(yīng)用提供實(shí)驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.通過腦定位儀在大鼠海馬區(qū)內(nèi)注射Aβ1-40建立AD模型,并用遠(yuǎn)志皂苷連續(xù)灌胃25天。用HE染色和透射電鏡方式觀察Aβ1-40對大鼠海馬神經(jīng)元的毒性作用及遠(yuǎn)志皂苷對海馬神經(jīng)元病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。
　　2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測遠(yuǎn)志皂苷對AD模型大鼠海馬神經(jīng)元線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡率的影響。
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察遠(yuǎn)志皂苷對大

4、鼠海馬神經(jīng)元線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,Bax,Cyt-c表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠海馬區(qū)內(nèi)注射Aβ1-4025天后,模型組大鼠神經(jīng)元形態(tài)和凋亡數(shù)量均發(fā)生變化,HE和剛果紅染色結(jié)果顯示神經(jīng)元數(shù)量減少,胞體退化,胞核固縮深染,核小,呈扁圓形或三角形,核仁不明顯;胞質(zhì)較少,少量細(xì)胞出現(xiàn)空泡性變化;遠(yuǎn)志皂苷治療組動物用藥25天后,其神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)與模型組比較,神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多,形態(tài)也較完整。透射電鏡結(jié)果顯示模型組海

5、馬神經(jīng)細(xì)胞雙層膜結(jié)構(gòu)模糊,胞質(zhì)疏松,出現(xiàn)較多電子密度高的團(tuán)塊,脂褐質(zhì)沉積,線粒體數(shù)目減少,結(jié)構(gòu)腫脹空泡變性,甚至線粒體嵴畸變;遠(yuǎn)志皂苷治療組與模型組相比細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有所好轉(zhuǎn),結(jié)構(gòu)較為完整,線粒體數(shù)目增多。
　　2.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示大鼠海馬CA1區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ1-40后,模型組大鼠△Ψm水平較假手術(shù)組明顯下降,而細(xì)胞凋亡率水平明顯上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示,假手術(shù)組比較,模型組、遠(yuǎn)志皂苷各劑量治療組

6、的Bcl-2的表達(dá)顯著提高,而與模型組比較,遠(yuǎn)志皂苷高、中劑量治療組Bcl-2的表達(dá)亦有顯著性提高,說明神經(jīng)細(xì)胞可通過Bcl-2的過量表達(dá)來抑制Aβ1-40引起的細(xì)胞凋亡。而模型組Bax表達(dá)量較假手術(shù)組和遠(yuǎn)志皂苷各劑量治療組明顯增強(qiáng),致使Bax/Bcl-2比值明顯上升,與流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率相吻合,提示Bax/Bcl-2比值是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。細(xì)胞色素C是凋亡的啟動子,假手術(shù)組和遠(yuǎn)志皂苷治療組細(xì)胞色素C表達(dá)量顯著低于模型組,提示遠(yuǎn)

7、志皂苷可通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體向胞質(zhì)釋放來達(dá)到抗凋亡的作用。
　　結(jié)論:
　　1.線粒體結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ),本研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志皂苷能抑制Aβ的神經(jīng)毒性,保持AD模型大鼠神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)完整,維持線粒體功能。
　　2.線粒體是凋亡的調(diào)控中心,本研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志皂苷可通過維持線粒體膜電位,保持線粒體氧化磷酸化的偶聯(lián)程度,上調(diào)Bcl-2表達(dá)量,降低Bax表達(dá)量,保持線粒體膜通透性,抑制凋亡啟動因子細(xì)胞色素C由線粒體釋放至細(xì)胞