β-淀粉樣蛋白致神經(jīng)元損傷及多奈哌齊對(duì)海馬結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以進(jìn)行性癡呆為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。隨著人口的逐漸老齡化，AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，由于缺乏有效的治療手段，AD已成為危害人類健康的主要致死性疾病之一。AD典型病理特征包括：β—淀粉樣蛋白(β—amyloid，Aβ)在腦內(nèi)神經(jīng)元外病理性沉積形成的老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)元內(nèi)微絲微管高度螺旋化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)

2、(neurofibrillary tangles，NFTs)和神經(jīng)元的大量丟失。到目前為止，AD的具體發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，但越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)元凋亡是導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的重要原因，神經(jīng)元的大量丟失致使AD患者認(rèn)知功能的進(jìn)行性下降?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)事件的結(jié)果，其中caspase—3被證實(shí)處于該級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，它通過降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)底物使細(xì)胞死亡，是凋亡事件的真正執(zhí)行者。海馬結(jié)構(gòu)

3、與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，且是AD最早和最易受損的部位，因此，海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元的凋亡直接影響到AD患者的認(rèn)知功能。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為：Aβ在腦組織中的沉積是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，也是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明：Aβ的異常沉積可以啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白參與的系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，損傷神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙等。但究竟有哪些蛋白和酶參與了Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷，以及這些蛋白分子之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制如何？目前尚

4、未完全闡明。因此，進(jìn)一步探討Aβ致神經(jīng)元損傷作用具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。 PI3—K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的促細(xì)胞存活途徑，PI3—K在生長因子受體等胞外信號(hào)活化后，通過磷酸化下游蛋白激酶Akt而使其活化，活化的Akt可以磷酸化凋亡相關(guān)基因，使促凋亡基因失活、抗凋亡基因活化，從而起到抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。那么，Aβ致神經(jīng)元損傷作用是否與抑制了Akt的活化有關(guān)呢？關(guān)于這方面的研究國內(nèi)外報(bào)道尚少。 多

5、奈哌齊(Donepezil，DN)作為一種選擇性的膽堿酯酶抑制劑而用于臨床AD的治療，能明顯提高AD患者的學(xué)習(xí)記憶能力。目前體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)DN可減少自由基的產(chǎn)生、抑制谷氨酸的興奮性毒性，但其是否可減少Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，抑制凋亡相關(guān)基因caspase—3的表達(dá)，以及此作用是否與Akt的活化有關(guān)等研究國內(nèi)外報(bào)道還很少。 因此，本研究擬采用體內(nèi)外研究相結(jié)合的方法，分別進(jìn)行體外Aβ干預(yù)大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(Phaeochromocy

6、toma cell，PC12細(xì)胞)，體內(nèi)大鼠側(cè)腦室注射Aβ，同時(shí)給予多奈哌齊進(jìn)行治療，探討Aβ對(duì)神經(jīng)元的損傷作用及多奈哌齊對(duì)海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元的保護(hù)作用以及它們作用的可能機(jī)制。從而進(jìn)一步研究Aβ的神經(jīng)毒性，同時(shí)為DN的臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為預(yù)防或治療AD及其藥物開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。 材料與方法: 一、體外研究 1、細(xì)胞培養(yǎng)：PC12細(xì)胞在含10％胎牛血清、5％馬血清的RPMI—1640培養(yǎng)基，37℃，5％CO2

7、培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。 2、MTT比色法：選用不同濃度Aβ25—35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞，24h后檢測各濃度細(xì)胞的存活率，并選擇Aβ25—35的最適濃度建立神經(jīng)元損傷模型。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組，即：未經(jīng)處理的PC12細(xì)胞作為對(duì)照組，最適濃度Aβ25—35干預(yù)組為模型組。 3、流式細(xì)胞術(shù)：分別檢測上述兩組PC12細(xì)胞的凋亡率。 4、細(xì)胞免疫組化法：分別檢測上述兩組PC12細(xì)胞caspase—3的表達(dá)。 二、體內(nèi)

8、研究 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選用中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雄性Wistar大鼠36只，3月齡，體重250～300g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，將大鼠隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、模型組及治療組，每組各12只。模型組、治療組大鼠側(cè)腦室注射Aβ25—3510μl(1μg/μl)，對(duì)照組大鼠采用相同方法注射等量0.9％生理鹽水。治療組于側(cè)腦室注射后第3d開始腹腔注射多奈哌齊1.5mg·kg—1·d—1，正常對(duì)照組、模型組給予等量生理鹽水，持續(xù)4w

9、。 2、Morris水迷宮行為學(xué)測試：測試各組大鼠的近期學(xué)習(xí)記憶能力，記錄其每個(gè)時(shí)間段的平均逃避潛伏期。 3、免疫組織化學(xué)染色法：觀察各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元caspase—3陽性細(xì)胞的分布和表達(dá)情況。 4、Western blot方法：分析各組大鼠海馬結(jié)構(gòu)T—Akt、P—Akt的表達(dá)水平。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)合圖像采集分析系統(tǒng)，體內(nèi)外研究的全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS11

10、.5統(tǒng)計(jì)軟件，用單因素方差分析方法進(jìn)行組間比較，p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 一、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、MTT比色法：檢測到PC12細(xì)胞活性呈Aβ25—35濃度依賴性下降，Aβ25—35的最適作用濃度是20μM。 2、流式細(xì)胞術(shù)：檢測到模型組PC12的凋亡率較對(duì)照組明顯增加。 3、免疫組化染色：模型組caspase—3的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多(P<0.01)。

11、 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、Morris水迷宮測試：模型組大鼠各時(shí)間段的平均潛伏期較對(duì)照組延長(P<0.01)，而治療組各時(shí)間段的平均潛伏期較模型組縮短(p<0.05)。 2、免疫組織化學(xué)方法：caspase—3陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色細(xì)顆粒狀，主要沉積在海馬結(jié)構(gòu)CA1、CA3區(qū)的錐體細(xì)胞層及齒狀回(DG)的顆粒細(xì)胞層。對(duì)照組大鼠海馬結(jié)構(gòu)3個(gè)亞區(qū)可見少量的caspase—3陽性神經(jīng)元；模型組陽性神經(jīng)元較多，陽性反

12、應(yīng)產(chǎn)物著色較對(duì)照組加深，平均光密度值均較對(duì)照組明顯增高(P<0.01)；而治療組caspase—3陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值均較模型組減少(P<0.05)。 3、Western blot方法：三組大鼠海馬結(jié)構(gòu)的T—Akt的表達(dá)量無顯著差異(P<0.05)，模型組P—Akt的表達(dá)較對(duì)照組降低(P<0.05)，治療組P—Akt的表達(dá)量相對(duì)于模型組呈升高趨勢(p<0.05)。 結(jié)論: 1、Aβ25—35誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡與