鹽酸多奈哌齊對沙鼠短暫性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　 腦缺血即腦的短暫性血液供應(yīng)不足，是一種急性的神經(jīng)損傷，是人類三大死亡原因之一。血管性癡呆(vascular dementia, VD)是由各種腦血管疾病導(dǎo)致的獲得性、持續(xù)性認(rèn)知障礙綜合征。目前認(rèn)為，大腦反復(fù)缺血再灌注是造成VD的主要原因之一。腦缺血可造成海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元壞死，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶及空間定向等一系列行為障礙。沙鼠雙側(cè)頸動脈閉塞全腦腦缺血模型與人類的頸動脈閉塞很相似，是研究人類腦缺血的理想動物模型。

2、
　　 鹽酸多奈哌齊是第二代治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)的膽堿酯酶抑制劑，具有較強的乙酰膽堿酯酶抑制作用，能夠增加動物大腦乙酰膽堿含量，具有改善學(xué)習(xí)記憶障礙、選擇性強、作用時間長、無肝臟毒性等特點，其抑制作用是可逆的、非競爭性的，通過抑制AchE，能夠使直接參與神經(jīng)傳遞的突觸間隙的Ach含量增加，是應(yīng)用于AD的輕、中度對癥治療藥。越來越多的證據(jù)表明，血管性癡呆患者有著與AD患者類似的膽堿能物

3、質(zhì)缺乏，因而膽堿能藥物（膽堿前體和膽堿酯酶抑制劑）也逐漸用于VD臨床治療，以改善血管性癡呆患者的認(rèn)知功能。
　　 本研究通過Morris水迷宮實驗比較各組沙鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，以及比較Ca2＋-CaMK-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p-CaMKⅡ和p-CREB磷酸化蛋白水平的變化和海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)的變化，為闡明鹽酸多奈哌齊對沙鼠腦缺血保護(hù)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、動物、試劑與儀器
　　

4、 雄性沙鼠，Bradford法測定蛋白濃度試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司），彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（碧云天生物技術(shù)公司），DYY-5型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀電泳儀（北京六一儀器），Hoefer miniVE垂直電泳，低溫高速離心機(jī)（Centrifuge5810R,德國Eppendorf），蘇木素染液和伊紅染液（南京建成生物工程研究所），LeicaCM1900冰凍切片機(jī)，OLYMPUS BX51等。
　　 2、沙鼠腦缺血模型制備及給藥

5、
　　 36只雄沙鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組、缺血治療組，每組各12只，乙醚麻醉，頸部正中切口，分離兩側(cè)頸總動脈，無創(chuàng)傷微血管夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，阻斷血流10min后再灌注，消毒，縫合創(chuàng)口，放回原條件下飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不夾閉頸總動脈外，其余操作同上。缺血治療組從手術(shù)后當(dāng)天連續(xù)灌胃給藥(5mg/kg/d)三周，假手術(shù)組、缺血組從手術(shù)后當(dāng)天連續(xù)灌胃給相同體積的生理鹽水三周。
　　 3、神經(jīng)學(xué)評價
　　 手術(shù)24h后觀

6、察各組沙鼠的神經(jīng)癥狀，按五個等級評分：0，無癥狀；1，背部弓起；2，強直性癲癇發(fā)作；3，上瞼下垂；4，無意識。評價后分值越高，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。
　　 4、Morris水迷宮實驗測試各組沙鼠的學(xué)習(xí)記憶能力
　　 Morris水迷宮行為學(xué)測試各組沙鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，訓(xùn)練四天后，記錄其每天的平均逃避潛伏期（四天）和最后一天的90s內(nèi)的穿臺次數(shù)。
　　 5、HE染色觀察各組沙鼠的海馬CA1區(qū)
　　 HE染色觀察各

7、組沙鼠的腦內(nèi)海馬CA1區(qū)病理變化。
　　 6、Western blotting方法檢測p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白表達(dá)
　　 提取各組沙鼠腦海馬組織中p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白，考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量，經(jīng)10％SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，一、二抗孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。
　　 7、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 結(jié)合圖像采集分析系統(tǒng)，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)

8、計軟件，除水迷宮的潛伏期數(shù)據(jù)用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，其他數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、神經(jīng)學(xué)評價結(jié)果顯示缺血組和缺血治療組的分值明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），而缺血組與缺血治療組無差異（P＞0.05）。
　　 2、Morris水迷宮結(jié)果顯示缺血組每天的平均潛伏期較假手術(shù)組的延長(P＜0.01)，而缺血組與缺血治療組

9、之間比較無差異（P＞0.05）。最后一天的穿臺實驗結(jié)果顯示缺血組穿臺次數(shù)明顯少于假手術(shù)組(P＜0.05)，缺血治療組的穿臺次數(shù)明顯多于缺血組，而缺血治療組與假手術(shù)組無差異（P＞0.05）。
　　 3、HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊緊密，缺血組失去正常結(jié)構(gòu)，錐體細(xì)胞層次極其紊亂有空泡樣變，錐體細(xì)胞減少，缺血治療組錐體細(xì)胞排列較緊密，未見空泡樣變，錐體細(xì)胞較缺血組有所增加（P＜0.05）。
　　 4、W

10、estern blotting結(jié)果顯示缺血組沙鼠腦海馬組織中p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組和治療組減少（P＜0.05），而假手術(shù)組與缺血治療組比較無差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、沙鼠腦缺血再灌注24h后能引起神經(jīng)損傷，而鹽酸多奈哌齊不能快速改善神經(jīng)損傷。
　　 2、沙鼠腦缺血組海馬組織中的p-CaMKⅡ和p-CREB蛋白水平的表達(dá)較假手術(shù)組減少。
　　 3、缺血治療組海