電針干預對大鼠腦缺血再灌注后神經元凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、目的：觀察電針對大鼠急性局灶性腦缺血再灌注后神經元凋亡和 caspase-3 表達的影響，探討線粒體介導的凋亡通路在缺血性腦損傷中的作用及電針干預作用的可能機制，為電針治療缺血性腦血管病提供實驗依據。 方法： 1.動物模型的制備：采用大腦中動脈栓塞法、(MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。雄性 SD 大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，分離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。結扎剪斷ECA，用肝素處

2、理過的尼龍栓子沿剪口從頸外動脈殘端插入，經CCA進入ICA，以CCA分叉處計算進線深度為 18.0±0.5mm，至大腦中動脈起始部，造成局灶性腦缺血狀態(tài)，缺血30 min后緩慢拔出尼龍栓子再灌注 24 h。 2.電針方法：大鼠穴位定位參考《實驗動物穴位圖譜》。電針治療組大鼠選取“水溝”和“百會”穴，應用韓氏穴位神經刺激儀，頻率2～15 Hz，間斷疏密波，電流強度1 mA，以肌肉輕微震顫為度，持續(xù)時間30 min。 3.線

3、粒體膜電位及凋亡發(fā)生率的測定：雄性SD大鼠，隨機分為假手術實驗對照組(sham)、腦缺血再灌注組(I/R)和腦缺血再灌注+針刺組 (I/R+EA)。腦缺血再灌注24 h后取腦組織制備單細胞懸液，用羅丹明123(Rhodamine 123)和AnnexinV-FITC 進行熒光染色，通過流式細胞儀檢測細胞內熒光強度，分析腦組織細胞線粒體膜電位及凋亡發(fā)生率的變化。 4.Caspase-3蛋白免疫熒光組織化學檢測：雄性SD大鼠，隨機分

4、為sham組、I/R和I/R+EA 組。用共聚焦激光掃描顯微鏡對免疫熒光雙標的缺血腦片進行雙通道斷層掃描，觀察腦缺血再灌注24 h后大鼠大腦皮層 caspase-3 蛋白陽性細胞熒光強度的變化。 5.Caspase-3 mRNA RT-PCR 擴增：雄性SD大鼠，隨機分為sham組、I/R 和 FR+EA 組。應用逆轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)，觀察腦缺血再灌注24 h大鼠大腦皮層 caspase-3 mRNA 表達的變化。

5、 結果： 1.I/R 組腦組織細胞線粒體膜電位較sham組明顯下降(P<0.01)：EA組線粒體膜電位顯著升高，與I/R組相比有顯著性差異(P<0.01)，但較sham組線粒體膜電位仍明顯降低(P<0.01)，結果有統(tǒng)計學意義。 2.I/R 組腦組織細胞凋亡率較sham組明顯增高(P<0.01)；EA組細胞凋亡率顯著降低，與I/R組相比有顯著性差異(P<0.01)。 3.共聚焦激光掃描顯微鏡觀察發(fā)現，casp

6、ase-3蛋白陽性細胞顯示為綠色熒光，主要在神經元胞漿內表達，細胞核少量表達。I/R 組 caspase-3 蛋白陽性細胞平均熒光強度與sham組比較顯著升高(P<0.01)；EA組easpase-3蛋白陽性細胞平均熒光強度明顯下降，較I/R組有顯著性差異(P<0.01)，但較sham組平均熒光強度仍明顯升高，結果有統(tǒng)計學意義。 4.I/R 組大腦皮層caspase-3 mRNA表達與sham組相比明顯升高(P<0.01)；電針

7、治療后caspase-3 mRNA表達下調，與I/R組相比有顯著性差異(P<0.01)，但較sham組仍明顯升高(P<0.01)，結果有統(tǒng)計學意義。 結論： 1.急性局灶性腦缺血再灌注后大鼠大腦皮層區(qū)腦組織細胞線粒體膜電位下降、凋亡發(fā)生率升高、easpase-3 mRNA及蛋白表達均明顯升高。 2.電針治療降低中風致殘率和死亡率的機理可能和其改善腦組織細胞線粒體膜電位水平、降低凋亡發(fā)生率、下調 caspase-3